輔助生殖技術操作規(guī)范

輔助生殖技術操作規(guī)范第1章人工授精第2章體外受精-胚胎移植技術第3章體外受精-胚胎移植及其衍生技術第4章輔助生殖技術并發(fā)癥

第1章人工授精一、概述人工授精（artificialinseminati。n，AI)是指采用非性交的方式將精子遞送到女性生殖道來達到生育目標的系列技術。按照其精子的來源，AI可分為來自丈夫精子的夫精人工授精（artificialinseminati。nwithhusbandsemen，AIH）和來自第三方精子的供精人工授精（artificialinseminati。nwithd。n。rsemen,AID)。1790年，英國人J。hnHunter首次用注射器將尿道下裂患者精液注射到其妻子陰道內(nèi)獲得正常妊娠:1884年，費城WilianPankhurst首次采用供者精液進行AI治療獲得成功。AI也可按照不同授精部位分類，如陰道、宮頸管、宮腔、輸卵管和腹腔的授精被分別稱為陰道內(nèi)人工授精（intrayaginalinseminati。n,IVI)、宮頸管內(nèi)人工授精（intraceryicalinseminati。n，ICI)、宮腔內(nèi)人工授精（intrauterineinseminati。n,IUI)、輸卵管內(nèi)人工授精（intrafal。pianinseminati。n,IFI)和腹腔內(nèi)人工授精（intraperit。nealinseminati。n,IPI)。1866年，紐約城婦產(chǎn)醫(yī)院的Mari。nsims采用ICI/IUI技術治療性交后試驗陰性的不孕婦女獲得了一例成功。ICI和IUI仍然是目前最常用的AI治療技術，ICI多用于男性精液參數(shù)正常，但生殖器發(fā)育異常（如尿道下裂)、性功能或射精功能障礙的不孕夫婦，以及需要接受AID治療的患者:IUI則主要用于男性少弱精子癥、女性宮頸異常相關的輔助生殖治療。體外受精（inyitr。fertilizati。n，IVF）技術的出現(xiàn)帶動了精子制備技術的發(fā)展。精子的洗滌、上游、下游，以及密度梯度分離等系列技術的臨床應用再次喚起了人們對AI技術治療的關注。相對于IVF技術，AI技術較為簡單、價廉，相對較少地干預正常的生殖過程，因而有更廣的適應證范圍，被認為是輔助生殖技術（asistedrepr。ductiyetechn。l。gies,ART)中一線治療技術。二、機構開展AI治療的設置標準在我國，AI和其他ART技術一樣，屬于限制性使用技術，設置AI技術治療機構需要符合區(qū)域衛(wèi)生行政規(guī)劃和行業(yè)法規(guī)的基本標準。為此，衛(wèi)生部頒布了《人類輔助生殖技術管理辦法》（2001年衛(wèi)生部14號部長令)、《衛(wèi)生部關于修訂人類輔助生殖技術與人類精子庫相關規(guī)范、基本標準和倫理原則的通知》（衛(wèi)科教發(fā)[2003]176號）和《衛(wèi)生部人類輔助生殖技術與人類精子庫校驗實施細則》（衛(wèi)科教發(fā)[2006]44號）等系列法規(guī)，其中，對開展AI的機構設置、人員要求、工作場所、設備條件、質量控制標準進行了最低標準規(guī)定，提出了制度和倫理規(guī)范化管理的系列要求，以及動態(tài)化的管理模式 （見衛(wèi)生部相關文件)。三、夫精人工授精技術診療常規(guī)（一）夫精人工授精技術臨床診療常規(guī)1.適應證（1）男方因素:精液液化異常，逆行射精，性功能障礙，生殖器畸形等。如精液常規(guī)分析參數(shù)正常可考慮ICI治療;男性少、弱精子癥等可進行精子制備后行IUI治療，但制備后前向運動的精子數(shù)不宜少于500萬條（過少的前向運動精子數(shù)會使臨床妊娠率下降)。（2）女方因素:女方至少有一側輸卵管完全暢通，且輸卵管碘油造影證實無影響輸卵管拾卵功能的盆腔粘連，但有宮頸因素不育;或生殖道畸形及心理因素導致性交障礙等;或排卵障礙促排卵治療無效后;或子宮內(nèi)膜異位癥等。（3）免疫性因素:精液抗精子抗體檢測時，至少在一份精液樣本中，發(fā)現(xiàn)有50%或以上的活動精子包被，且經(jīng)過精子-宮頸黏液接觸實驗、體內(nèi)性交后實驗、體外精子-宮頸黏液接觸實驗等評估抗體生物學重要性后加以證實。（4）原因不明不孕。（5）符合計劃生育政策。2.禁忌證（1）男女一方患有生殖泌尿系統(tǒng)急性感染或性傳播疾病。（2）一方患有嚴重的遺傳、軀體疾病或精神心理疾患。（3）一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期。（4）一方有吸毒等嚴重不良嗜好。3.門診檢查常規(guī)宜于AIH治療前1個月左右就診完成術前檢查，要求患者準備身份證、結婚證、生育證。門診檢查包括以下內(nèi)容。（1）男女雙方病史采集。包括不孕不育年限（未采用避孕的時間）;婚姻狀況、曾用過的避孕方法;初潮年齡、月經(jīng)周期、經(jīng)期、末次月經(jīng)、是否伴發(fā)痛經(jīng)及其發(fā)生的時間和嚴重程度;孕產(chǎn)史、伴發(fā)的并發(fā)癥;近期心理、情緒、進食、過度運動史;盆腹腔痛、低熱、畏寒、白帶異常史;泌乳、多毛、痤瘡、體重改變史;既往結核等特殊傳染病史、盆腔炎、既往性傳播疾病史，以及治療情況;盆腔或腹腔手術史、自身免疫性疾病史、既往重病和外傷史以及幼時的特殊患病史;藥物過敏史;吸煙、酗酒、成癮性藥物、吸毒史;職業(yè)以及特殊環(huán)境、毒物接觸史;家族中有無出生缺陷、智障、不孕不育史。近期不育相關檢查及治療經(jīng)過。男性還包括青春期開始時間、性交頻率和時間、有無勃起和（或）射精障礙;有無與其他配偶懷孕;有無性傳播疾病、泌尿生殖系感染、腮腺炎合并睪丸炎或其他病毒性睪丸炎;有無腎臟疾病、糖尿病、附睪炎、纖維病變、結核，及其他全身性疾病;有無睪丸手術、腹股溝疝修補術、輸精管結扎、陰囊損傷、睪丸扭轉，以及其他盆腔和腹腔手術史;是否有高溫、放射和有毒環(huán)境暴露史，煙酒、咖啡因攝人史;有無服用磺胺類抗生素、合成代謝的類固醇激素等生殖毒性藥物;有無隱睪、男性乳腺增生、性腺低下、嗅覺喪失、中線缺陷（腭裂)、男性纖維病變等先天性發(fā)育異常。（2）體格檢查。女性的體格檢查至少包括:體格發(fā)育及營養(yǎng)狀況、身高、體重、體脂分布特征、乳房及甲狀腺情況等;是否呈現(xiàn)雄激素過多體征:多毛、痤瘡、黑棘皮征等;外陰發(fā)育、陰毛分布、陰道和宮頸異常排液和分泌物;子宮大小、形狀、位置和活動度;附件包塊和壓痛;子宮直腸凹處的包塊、觸痛和結節(jié);盆腔和腹壁壓痛、反跳痛;盆腔包塊。男性的體格檢查至少包括:身高、體重、血壓及是否肥胖;男性第二性征發(fā)育、男性乳房發(fā)育;陰莖（有無尿道下裂、瘢痕、硬斑、潰瘍或尿道分泌物)、睪丸（有無下降不全、異位或回縮;睪丸體積是否12ml;睪丸質地、有無陰囊腫塊)、附睪（能否觸及，位置，有無囊腫、結節(jié)及壓痛)、輸精管（能否觸及，有無增厚，結節(jié)及觸痛)、腹股溝區(qū)檢查（有無疝、瘢痕或淋巴結腫大、有無精索靜脈曲張)、前列腺（有無疼痛，或質地堅硬)、精囊（可否觸及、有無壓痛）等生殖系統(tǒng)檢查。（3）輔助檢查和實驗室檢查。女方檢查包括:基礎體溫測定;子宮輸卵管碘油造影術或腹腔鏡等手術確認輸卵管是否通暢、排除盆腔粘連;排除不能耐受妊娠的疾病等;基礎內(nèi)分泌檢查:雌二醇（E2)、促卵泡生成素（FsH)、促黃體生成素（LH)、睪酮（T)、催乳素（PRL）;抗子宮內(nèi)膜抗體、抗心磷脂抗體檢測;風疹病毒、弓形蟲、皰疹病毒、巨細胞病毒篩查;白帶常規(guī)、宮頸分泌物支原體、衣原體、線索細胞、宮頸涂片檢查;空腹血糖。推薦進行胸部x線片、心電圖檢查。男女雙方的檢查包括:血/尿常規(guī)、肝腎功能、紅細胞沉降率、血型（AB0Rh）;乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒、淋球菌;抗精子抗體。如有下列情況推薦進行染色體檢測:①有習慣性流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史;②出生過畸形、智力低下或者染色體病患兒;③原發(fā)不孕。男方檢查包括:精液分析;男方為少精子癥時，進行染色體檢測和Y染色體微缺失檢測。4.臨床操作常規(guī)（1）啟動治療前，機構應根據(jù)我國現(xiàn)行計劃生育政策的要求查驗和復印身份證、結婚證和準生證;給病人進行相關信息和注意事項的宣教、溝通，必要時予個體化的心理輔導，最后簽訂簽署知情同意書。（2）建立檔案:臨床醫(yī)生負責書寫專科病歷，并核對術前準備的各項檢測是否正常（臨床檢測1年內(nèi)有效)。（3）制訂治療方案:臨床組醫(yī)生應根據(jù)患者個體情況，討論和制定用藥方案及授精方式。（4）排卵監(jiān)測與授精時機。①對有規(guī)律月經(jīng)周期且有自行排卵的女性，可在自然的月經(jīng)周期中根據(jù)月經(jīng)周期的天數(shù)、宮頸黏液評分、基礎體溫的測定、結合血或尿LH水平及陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育來判定。通常可在周期的第9-11天開始行B超卵泡發(fā)育監(jiān)測，當優(yōu)勢卵泡直徑達16mm時，可開始宮頸黏液評分和半定量尿LH的監(jiān)測。當達到18mm或以上時，可酌情抽血監(jiān)測E2、LH水平直到排卵日。月經(jīng)周期:育齡女性的正常月經(jīng)周期為21-35d，平均月經(jīng)周期為28d。當月經(jīng)周期為28d時，排卵發(fā)生于第13-15天。有些女性在月經(jīng)周期中期可出現(xiàn)與排卵有關腹痛?；A體溫確定:在月經(jīng)周期的卵泡期，基礎體溫相對較低，在排卵期由于產(chǎn)生黃體酮（孕酮)，體溫至少升高0.5℃，這一體溫持續(xù)幾天。在體溫雙相的轉換日或其后1天被認為是排卵日。宮頸黏液評分:常用Bilings評分法，根據(jù)黏液量、拉絲度、結晶及宮口關閉和開張情況客觀地評價宮頸黏液。黏液產(chǎn)生開始時是濃稠的、渾濁的，接近排卵時，黏液變得豐富，光滑透明，有彈性，這種狀況利于精子通過，改變2-3d;排卵后，黏液再次變得黏稠。人工授精應在宮頸黏液最大評分日施行。LH水平的測定:尿LH峰后12-24h排卵。臨床常應用尿試紙測定尿LH峰來預測排卵，試驗從第11天開始，直到排卵。此方法簡單、價格低廉、可自行監(jiān)測。自然周期血LH峰出現(xiàn)后24-36h排卵。超聲監(jiān)測:可動態(tài)直觀的監(jiān)測卵泡地生長發(fā)育和排卵情況。卵發(fā)育時，卵泡增大，排卵前，卵泡壁薄，充滿液體，排卵通常發(fā)生在卵泡直徑達18-25mm時。已排卵的超聲波表現(xiàn)為成熟卵泡驟然消失或成熟卵泡明顯縮小，且卵泡內(nèi)透聲減弱，直腸子宮陷凹出現(xiàn)液體積聚。宜在排卵前24h內(nèi)行人工授精。次日行B超檢查排卵情況，若仍未排卵可以考慮再次行AI治療。當主導卵泡直徑達18mm以上且出現(xiàn)尿LH峰時，則于LH峰后12-24h左右授精一次;當主卵泡直徑達18-20mm仍無LH峰出現(xiàn)時，注射HCG5000-10000U,授精時間一般為HCG后36-40h。②對于有排卵障礙（如多囊卵巢綜合征、下丘腦性閉經(jīng)等)、原因不明不孕、自然周期卵泡發(fā)育不良、自然周期失敗或年齡較大（35周歲及以上）等病因的患者，可采用藥物誘導排卵。有多種誘導排卵的方案適應于不同情形下的AI治療。通常，在誘導排卵周期用藥日，應行B超觀察基礎卵泡的數(shù)目及大小，用藥過程中應進行B超監(jiān)測卵泡生長和發(fā)育、子宮內(nèi)膜同步增長情況，指導藥物劑量的調整。若卵泡直徑≥12mm,則隔天進行B超、LH檢查監(jiān)測卵泡發(fā)育，囑男方手淫法排精1次;當卵泡直徑≥14mm時，每日B超監(jiān)測和LH檢查直至排卵。若卵泡直徑達18-20mm,尿LH陽性者，可注射人絨毛膜促性腺激素（humanch。ri。nicg。nad。tr。pin,HCG)，用于精確地預測排卵時間（HCG注射宜在內(nèi)源性LH峰開始之前)，于當天下午或次日行AI;若尿LH陰性者，當天晚上10點注射HCG5000-10000U,次日上午行IUI。常用的藥物誘導排卵方案包括:氯米芬（cl。mifenecitrate,C）+HCG方案:適用于體內(nèi)有一定內(nèi)源性雌激素水平的無排卵患者。月經(jīng)第3-5天或黃體酮撤退出血第3-5天給C50-100mg/d，連續(xù)5-7d用藥。當主導卵泡18mm,予HCG5000-10000U,肌內(nèi)注射，促進卵泡成熟。另可加用補佳樂1-2mg/d，改善C的抗雌激素作用。促性腺激素（g。nad。tr。pin,Gn）+HCG方案:適用于使用C誘導卵泡生長失敗者或低促性腺激素性閉經(jīng)。月經(jīng)第3-5天或黃體酮撤退出血第3-5天或測定血清激素水平，如果E250pg/ml,子宮內(nèi)膜厚度5mm,基礎卵泡直徑5mm,可開始給予促性腺激素，37.5-150U/d，肌內(nèi)注射，至卵泡成熟。C+Gn+HCG方案:適合于單用C卵泡發(fā)育欠佳者，可加用促性腺激素。月經(jīng)第3-5天或黃體酮撤退出血第3-5天給C50-100mg/d;第5-9天給HMG/FsH75-150U/d，之后根據(jù)卵泡發(fā)育情況調整劑量?？诜铣杀茉兴帲?。ralc。ntraceptiyes,0C）+促性腺激素釋放激素類似物（GnRHa）+HMG/FsH+HCG:主要適應于基礎LH10U/ml或既往有提前的LH峰現(xiàn)象的患者、PC0s患者。助孕前1-3個月經(jīng)周期口服合成避孕藥，月經(jīng)第21-23天注射長效GnRHa1.5-1.8mg,助孕周期MC3-5確定Em厚度6mm且已達降調節(jié)后（E250pg/ml,LH10mU/ml,F10mm)，開始予HMG/FsH75U,肌內(nèi)注射，每日1次，連用5-7d，之后根據(jù)卵泡發(fā)育情況調整劑量，一般以37.5-75U遞增或遞減方式調量。如3-5d未達到要求，繼續(xù)觀察3-5d，必要時改用超長方案或取消周期。在藥物誘導卵泡生長過程，應控制16mm卵泡數(shù)不應超過4個，避免多胎和卵巢過度刺激綜合征 （。yarianhyperstimulati。nsyndr。me,0Hss)的發(fā)生。以下情形必要時需采取卵泡穿刺輔助卵子釋放:①既往有卵泡黃素化未破裂綜合征史的患者，在注射HCG后40h觀察優(yōu)勢卵泡仍未破裂者;②16mm卵泡數(shù)目多于5個者，為防止多胎妊娠及0Hss，酌情采取卵泡穿刺術將多余卵泡抽出。（5）授精操作常規(guī):盡管可能的授精方法有5種，但目前臨床上常規(guī)使用主要是ICI和IUI兩種授精方式。①ICI:主要適用于性交不能、性交后不射精、精液不液化患者。術前排空膀胱，患者取膀胱截石位，臀部略抬高，以陰道窺器暴露子宮頸，用生理鹽水消毒棉球揩凈子宮頸外口周圍黏液，將裝有液化后精液的注射器以低壓緩慢注人子宮頸管內(nèi)，退出窺器，患者平臥1h。②IUI:是AIH最常用且成功率最高的人工授精方法，主要適用于男方少、弱、畸形精子癥，女方宮頸因素不孕，免疫性不孕，原因不明不孕等患者。授精前如患者子宮為極度前傾前屈，建議術前1h喝水250ml,其他患者術前均建議排空膀胱。體位同ICI,生理鹽水沖洗患者陰道及宮頸管外口，授精管吸出洗滌好的精液，護士和醫(yī)生以及患者相互核對后，排除管內(nèi)空氣后輕柔將授精管插入宮腔內(nèi)（一般過宮頸內(nèi)口1-2cm即可)，再將0.3-0.5ml制備后精子懸液緩慢注人宮腔后停留1min左右退管。術后患者抬高臀部臥床休息至少30min。（6）黃體支持:對于誘導排卵周期、年齡35歲、黃體功能不全、原因不明不孕等患者AI術后需行黃體支持。①黃體酮:可肌內(nèi)注射黃體酮20-40mg/d，從授精日開始，16d后驗血或尿HCG,妊娠后繼續(xù)使用至孕8-10周逐漸減量停藥。②HCG:AI術后可用HCG進行黃體支持，2000U/次，從授精日開始每3天肌內(nèi)注射1次，共3次。某些患者可考慮聯(lián)合應用或加用雌激素類藥物，0Hss高?；颊卟挥肏CG行黃體支持。（7）術后注意事項和隨訪:離院前向病人交代禁同房、禁盆浴、禁游泳2周;采用藥物誘導排卵的患者若有惡心、嘔吐、腹痛、嚴重腹脹、體重明顯增加等卵巢過度刺激癥狀，或其他特殊癥狀如陰道流血等應立即復診或當?shù)鼐驮\。①確定妊娠:AI術后16-18d如未行經(jīng)，則開始測尿HCG,若為陽性為妊娠;若弱陽性繼續(xù)黃體支持，過3d復查尿妊娠試驗，若為陽性為妊娠;若陰性為生化妊娠;若為弱陽性應繼續(xù)隨訪，以排除宮外孕。已診斷妊娠的病例應于術后30d左右行陰道B超檢查確定臨床妊娠情況，包括觀察有無宮內(nèi)孕囊、有幾個孕囊、孕囊內(nèi)有無胚芽及心搏、胚芽大小與孕周是否符合、有無宮腔積液，同時應仔細掃描雙附件，看有無宮外孕囊。如三胎以上妊娠，必須行減胎術。②隨訪:已確定妊娠的患者應繼續(xù)隨訪，包括早、中、晚孕期情況，分娩情況和新生兒情況，出生后1歲情況，以后不定期隨訪母嬰健康狀況。（8）并發(fā)癥及處理:術中的可能并發(fā)癥包括持續(xù)少量陰道流血;宮腔積血;下腹疼痛。術后應追蹤有無0Hss、卵巢扭轉等并發(fā)癥發(fā)生;經(jīng)促排卵后妊娠的病例即使宮內(nèi)見孕囊也不能排除宮內(nèi)外混合妊娠，如血HCG濃度上升緩慢更應高度警惕異位妊娠。①出血:少量的出血一般發(fā)生在宮頸外口和宮頸管，處理原則為壓迫止血，預防感染。較多量出血發(fā)生在卵泡穿刺術后，需要住院處理。②腹痛:術中一般發(fā)生在宮頸牽扯和精液注人速度過快時。術后出現(xiàn)應警惕0Hss和卵巢扭轉、破裂、感染、宮外孕、流產(chǎn)等。一般在操作停止后，腹痛會自行緩解;極少數(shù)發(fā)生劇烈腹痛者，可予阿托品0.5mg肌內(nèi)注射。其他情況對癥處理。③感染、休克:術時適當使用抗生素，極少發(fā)生，按照相關原則處理。④多胎妊娠:預防措施:盡量避免多卵泡發(fā)育，如優(yōu)勢卵泡≥4個，建議取消IUI或行卵泡穿刺術將多余卵泡抽出。處理原則:發(fā)生3胎及以上妊娠者，應在妊娠8+周實施減胎術。⑤卵巢過度刺激綜合征（0Hss）:慎重使用促排卵藥物，不予注射或減量注射HCG誘發(fā)排卵:不用HCG支持黃體;必要時可取消IUI周期或抽吸多余的卵泡后行IUI。處理原則:輕度嚴密觀察，鼓勵病人多飲水，少吃多餐進食;中到重度應住院治療，每天監(jiān)測出入量，腹圍;注意HCT,水電解質平衡，肝腎功能，血凝狀態(tài)，卵巢大小，腹水情況;鼓勵少量多次進食，鼓勵飲水，補充血容量、白蛋白及電解質;腹水及胸水嚴重者可抽胸腹水:在血容量不足和血液濃縮的情況下，不能使用利尿劑;其他對癥治療。⑥異位妊娠:發(fā)生率低，一旦確診必須住院治療。（9）性交后試驗（p。st-c。italtest,PCT）:是一種體內(nèi)宮頸黏液功能檢查，目的在于了解精子對子宮頸黏液的穿透性能，同時還可以了解宮頸黏液性狀，精液質量及性交是否成功等有關情況。①方法:試驗應選擇在排卵期進行，試驗前至少2d避免性交。在前一天晚上同房。檢查時將未用潤滑劑的陰道窺器置人，用吸管在陰道后穹窿部吸取混合樣本（證實精液確實曾存留于陰道內(nèi))。然后再用另一吸管吸取宮頸黏液標本。將這些標本置于載玻片上，加上蓋玻片，使用相差顯微鏡在標準厚度下進行檢查。性交后試驗檢測宮頸黏液的時間一般為9-24h。②結果分析:如果宮頸黏液中存在適量快速直線前向運動的精子，就可排除宮頸因素作為不育原因的可能性;PCT初試結果陰性或不正常，應重復進行性交后試驗。如果操作正常，重復檢測仍為陰性，則提示為宮頸黏液引起的不孕。③注意事項:同房時不能使用潤滑劑，也不能在性交后進行盆浴、陰道沖洗，在性交后可以沖淋浴。（二）實驗室操作常規(guī)1.取精時間安排當女方主導卵泡達15mm左右時，應通知男方排精一次，之后一直禁欲到授精日再取精（取精前一般禁欲48h至7d，過長或過短的禁欲時間均有礙精子的質量，但對于精液差的病例可適當延長禁欲時間)。2.精液收集取精時間安排在IUI前1-2h，核對夫婦證件（結婚證、身份證、計劃生育部門開具的生育證明)，確認丈夫身份，簽署《接受助孕夫婦取精認證書》。有條件的中心可留存精液樣本以備查。（1）環(huán)境:應有專用的取精室，室內(nèi)配有單人床和洗手裝置，環(huán)境溫馨、溫暖（20-24℃)、潔凈。病人在取精過程中須保持取精室周圍環(huán)境安靜，以免造成精神緊張引起取精困難。（2）常規(guī)精液采集方法:取精前患者丈夫先排尿沖洗下尿道，清洗雙手，將已寫上姓名及病歷號的取精杯交患者丈夫，并告知取精杯已消毒，勿污染杯內(nèi)壁。丈夫手淫取精，應將全部精液射人取精杯，立即將杯蓋旋緊盡快送實驗室處理（30min內(nèi))。實驗室收到取精杯后應記錄收到時間、核對姓名及證件，并留取備查精液樣本（當患者面留取一滴精液于蓋夫妻手印的濾紙上)。如手淫取精不成功，可通過性交將精液收集于專用的無毒無菌避孕套內(nèi)。 （3）逆行射精患者的精子采集方法:取精前夜（以21:00為宜）口服碳酸氫鈉（NaHC03)4g及200ml水，當日取精前1h再服4gNaHC03及200ml水，不可飲用提高尿液滲透壓的飲料，使尿液的滲透壓降低，最佳的尿液滲透壓范圍為280-320m0sm/L,尿液pH為6.8-8.5。取精前排空膀胱，手淫法射精后，立即將尿液排人盛有10mlHEPEs-精子洗滌液的取精杯內(nèi)，盡快送實驗室處理。（4）陽萎或射精障礙患者的精液采集:陽萎或射精障礙患者可采取適當藥物治療和心理輔導，當治療無效時，可通過附睪精子抽吸術取精。3.精液處理指通過特定的方法，最大程度地從精液中分離出形態(tài)正常、活動力強的精子，同時，去掉精漿和精液中可能攜帶的微生物等。常用的分離方法有上游法和密度梯度離心法。前者用于精液質量較好的精子制備，后者精子回收率較高，更適合于少、弱精子癥患者的精子制備，且對精漿和其他成分的分離效果好，是更為常用的方法。（1）密度梯度離心法:該方法利用不同成熟度、不同狀態(tài)精子（如正常、畸形和死精子等）的密度差異，在特定介質形成的密度梯度場中進行離心分離，達到將正常、活動力強的精子與其他精子和精漿成分分離的目標。適用于精液參數(shù)正常、精液參數(shù)較差或凍存精液患者的精子處理。①場地與設備要求:精子處理應在無菌、恒溫的環(huán)境下操作。處理前應檢查生物顯微鏡、離心機、C02培養(yǎng)箱和超凈工作臺是否處在正常的工作狀態(tài)。相關的器材包括精子計數(shù)板，無菌的15ml離心管、注射器、Pasteur吸管須準備到位。②試劑準備:通常采用商品化的精子分離專用密度梯度分離試劑，最常用的體系是由40%上層和80%下層組成。所有分離用試劑和精子洗滌用培養(yǎng)基均需在使用前預熱到37℃，采用碳酸鹽緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)基應提前一天配制好放人C02培養(yǎng)箱中平衡。③操作流程:采集的精液置于37℃培養(yǎng)箱液化15-30min,混勻后無菌獲取10ul至精子計數(shù)板，按WH0-5標準進行精液檢查，計算前向運動精子總數(shù)。對精液不液化、液化時間長的樣本，加入等體積的精子洗滌培養(yǎng)基，立即檢查并處理。首先，用2ml注射器將1.0-2.0ml80%下層分離液置于15ml離心管底部，再將1.0-2.0ml40%上層分離液緩慢加在下層上，注意一定要在上下層之間形成明顯的分界。分離液量的多少與精子的載量呈正相關。用Pasteur吸管慢慢沿著管壁加入1.0-2.0ml液化精液，以免與分離液混合。300gx（15-20)min離心;用Pasteur吸管獲取離心管底部的精子沉淀于新的無菌離心管，重懸于5ml精子洗滌用培養(yǎng)基;200gx10min離心;5ml精子洗滌用培養(yǎng)基重復洗滌一次后;精子重懸于0.3-0.5ml培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱備用，并測定精子的濃度和前向運動精子總數(shù)。④注意事項:精液有性傳播疾病等潛在的傳播風險，要按照生物安全流程操作和廢棄處理;有2份或以上樣本同時處理時須有全流程的2人核查和簽名;填寫實驗室精液處理記錄單，詳細填寫處理日期、方法、實驗室溫度、所使用試劑名稱和批號，處理前后精液的各項參數(shù)，計算前向精子的回收率。（2）上游法:上游法是利用活動精子在培養(yǎng)試管內(nèi)自主向上的趨向泳動能力，從培養(yǎng)液的上層液面收集活動能力強的精子，把活動力差的精子、死精子、凝集的精子、其他細胞成分和精漿蛋白質等分離，達到優(yōu)選精子的目的。①場地、設備和試劑準備:參見密度梯度離心法。②操作流程:將1ml精液，或將兩次洗滌以后的精子重懸于0.3-0.5ml培養(yǎng)基中，在精液或重懸液的上方，小心加入1ml培養(yǎng)基，將試管傾斜45。,置人37℃培養(yǎng)箱上游30-60min（時間根據(jù)精液質量來調整上游時間)，避免晃動。用無菌吸管吸取呈云霧狀上層液到另一支試管，再加培養(yǎng)液2ml混勻，200gx10min離心。棄上清液，精子重懸于0.3-0.5ml培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱備用，并測定精子的濃度和前向運動精子總數(shù)。③注意事項:同密度梯度離心法。四、供精人工授精技術診療常規(guī)供精人工授精技術臨床診療常規(guī)1.適應證（1）睪丸性無精子癥、梗阻性無精子癥、嚴重的少精子癥、弱精子癥和畸精子癥。（2）輸精管復通失敗。（3）射精障礙。（4）男方和（或）家族有不宜生育的嚴重遺傳性疾病。（5）母兒血型不合不能得到存活的新生兒。注意:適應證（1)、（2)、（3)中，除無法獲取精子的患者外，其他需行供精人工授精技術的患者，醫(yī)務人員必須向其交代清楚，通過卵母細胞胞質內(nèi)單精子顯微注射技術也可能使其有自己血親關系的后代，如果患者本人仍堅持放棄通過卵母細胞胞質內(nèi)單精子顯微注射技術助孕的權益，則必須與其簽署知情同意書后，方可采用供精人工授精技術助孕。2.禁忌證（1）女方患有生殖泌尿系統(tǒng)急性感染或性傳播疾病。（2）女方患有嚴重遺傳、軀體疾病或精神疾患。（3）女方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期。（4）女方有吸毒等不良嗜好。3.門診檢查常規(guī)（1）女方檢查:同夫精人工授精。（2）男方檢查:血型和精液檢查。（3）告知治療程序。①查驗患者夫婦身份證、結婚證原件及當?shù)赜媱澤块T開具的生育證明并收取復印件存人病歷檔案。②向患者夫婦詳細告知供精人工授精技術相關的知識、存在的風險，告之其可以選擇的其他方法、可能出現(xiàn)的并發(fā)癥和隨訪的要求等，簽署人工授精同意書。4.臨床操作常規(guī)參見夫精人工授精，供精人工授精根據(jù)授精部位也分為陰道內(nèi)人工授精、宮頸內(nèi)人工授精、宮腔內(nèi)人工授精，一般采用宮頸內(nèi)人工授精。供精人工授精一般在自然周期進行，有指征患者可在藥物誘導排卵周期進行。具體操作同夫精人工授精。5.實驗室操作常規(guī)供精人工授精須采用冷凍精液進行治療。冷凍精液必須來自于衛(wèi)生行政部門批準的人類精子庫。冷凍精液的解凍方法:將供精冷凍管從液氮中取出，擰松帽蓋，防止供精管在復蘇過程中爆裂，置37℃水浴迅速復蘇、混勻，無菌獲取10ul精液至精子計數(shù)板，按WH0-5標準進行精液檢查，計算前向運動精子總數(shù)。按照衛(wèi)生部技術規(guī)范的要求，解凍后精液用于宮腔內(nèi)人工授精治療時，要求復蘇后精液前向運動精子總數(shù)不得低于10x106/ml,前向運動的百分率不得低于40%。實施供精人工授精技術的機構應建立嚴格的保密措施，確?；颊叩膫€人隱私安全;應建立切實可行的隨訪機制，保證及時準確地向精子庫反饋妊娠及子代情況;應建立可靠的運行機制，配合計算機輔助管理系統(tǒng)，嚴格控制每一位供精者的冷凍精液最多只能使5名婦女受孕。第2章體外受精-胚胎移植技術第一節(jié)1VF-ET概況和發(fā)展史體外受精-胚胎移植技術（inyitr。fertilizati。nandembry。transfer,IVF-ET）是人類輔助生殖技術（asis-tedrepr。ductiyetechn。l。gy,ART）的基本內(nèi)容和核心技術，俗稱"試管嬰兒"技術。1978年7月25日，世界首例試管嬰兒L。uiseBr。wn在英國劍橋誕生，成為20世紀醫(yī)學史上的里程碑。1985年4月和1986年12月，我國臺灣、香港先后誕生了兩地的首例試管嬰兒。1988年3月10日，大陸的首例試管嬰兒也在北京醫(yī)科大學第三醫(yī)院張麗珠教授領導的生殖中心誕生。當今國際上采用的助孕新技術多數(shù)是從IVF-ET衍生出來的。如果從schenck嘗試在體外完成受精和Heape將供體兔子的胚胎成功地移植到受體子體內(nèi)開始，哺乳類的胚胎移植技術已有了100多年的歷史。20世紀60年代初期，家兔卵體外受精科學試驗首次成功，激發(fā)了胚胎學家Pr。f.R。bertG.Edwards想要嘗試進行人卵體外受精的實驗研究愿望，他與婦產(chǎn)科專家Mr.Patrickstept。e進行了10多年的合作努力，歷經(jīng)百余次失敗后，終于利用腹腔鏡技術，獲取自然周期的1枚排卵前卵母細胞，體外受精后形成的胚胎移植獲得成功妊娠分娩。全球許多國家生殖專家對研究這項劃時代的新技術充滿熱情，相繼在印度、澳大利亞、美國、歐洲多國獲得成功臨床應用。在世界首例試管嬰兒誕生30多年之后，2010年R。bertG.Edwards獲得了諾貝爾醫(yī)學或生理學獎，按照當年諾獎頒獎時估計，全世界已經(jīng)有約300萬個家庭通過IVF-ET技術得到自己的后代，試管嬰兒數(shù)量也達到了400萬個以上。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WH0）評估，世界上每7對夫婦中約有1對夫婦存在生殖障礙。我國近期調查，國內(nèi)不孕癥者占已婚夫婦人數(shù)的10%，比1984年調查的4.8%增加一倍多，發(fā)病率呈上升趨勢。臨床統(tǒng)計，不育患者中約20%的夫婦，不借助ART就根本無法生兒育女。在不孕癥病因中男性因素引起的不孕約占30%，女性因素約占50%，雙方因素約占20%。常規(guī)的或稱為傳統(tǒng)的IVF-ET技術主要是針對女性因素所致不孕癥或至少是在沒有嚴重的少弱精子癥時可以采用精子和卵混合培養(yǎng)方式完成體外受精，但對于曾經(jīng)嘗試常規(guī)受精但精卵未能自然結合，或因男性精子密度過低，活力較差等，或在評價精子功能后認為不能自然受精時，可以借助卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射受精技術實現(xiàn)精卵結合完成受精過程。卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射技術1992年在比利時首獲成功臨床應用，隨后這項技術迅速普及和發(fā)展，成為治療男性原發(fā)性生精低下，嚴重少弱畸精子癥，阻塞性無精子癥等所致不育的最主要手段。1983年，Tr。uns。nA報道首例經(jīng)凍融胚胎移植后成功妊娠分娩的試管嬰兒。如今，胚胎凍融技術已成為IVF中不可缺少的組成部分，胚胎凍融技術為充分利用促排卵周期形成的多余胚胎提供了保存和再利用的技術保障，避免胚胎浪費，增加累計妊娠機會。另外，近年來凍融胚胎技術還用于因促排卵周期發(fā)生卵巢過度刺激等新鮮周期不適宜移植的情況時，將全部胚胎凍存，在隨后的自然月經(jīng)周期或人工周期進行解凍胚胎移植，在更安全的情況下獲得更好的臨床結局。1991年英國學者開始將著床前胚胎遺傳學診斷技術（preimplantati。ngeneticdiagn。sis,PGD）用于臨床，這項技術是利用體外受精后形成的分裂球期胚胎的1個分裂球或囊胚期胚胎的少數(shù)滋養(yǎng)細胞進行相應的遺傳分析。在不孕不育患者中，部分夫婦不是表現(xiàn)為受孕困難，而是反復發(fā)生自然流產(chǎn)或有畸形胎兒出生，這些常與夫婦中某一方或雙方存在易造成流產(chǎn)的遺傳異常有關。目前已發(fā)現(xiàn)的人類遺傳病約4000余種，有些夫婦一方為異常染色體平衡攜帶者或性連鎖疾病攜帶狀態(tài)等，人群中存在這樣或那樣的遺傳缺陷。隨著單細胞分子遺傳學診斷技術的發(fā)展，特別是CGH和sNP芯片技術的推廣，PGD技術的應用近年來得到快速發(fā)展，使那些因遺傳問題不能順利生育的夫婦有望得到正常后代，避免反復流產(chǎn)或畸形兒的出生。IVF-ET技術還成為研究人類生殖過程、遺傳病機制、干細胞定向分化等的重要臨床資源，而這些課題的深人研究積累經(jīng)驗，必將推動醫(yī)學及生命科學的繼續(xù)發(fā)展。第二節(jié)體外受精.胚胎移植（1VF.ET）技術簡介將從母體取出的卵母細胞置于培養(yǎng)皿內(nèi)，利用適合人類卵母細胞生長的培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)，加入經(jīng)體外分離處理選擇出的有活力的精子，這些精子在與培養(yǎng)液接觸過程中已經(jīng)被誘導完成了體外獲能過程，精子和卵在體外共同培養(yǎng)過程中完成精卵結合的受精過程，受精卵繼續(xù)發(fā)育成早早期胚胎后，選擇受精正常且發(fā)育正常的胚胎移植回母體子宮內(nèi)，胚胎著床并且經(jīng)歷"十月懷胎"后嬰兒分娩。由于卵母細胞受精和受精卵及胚胎發(fā)育的最初幾天（最晚至囊胚期）是在體外培養(yǎng)環(huán)境中完成的，體外受精-胚胎移植技術（IVF-ET）也被俗稱為"試管嬰兒技術"。IVF-ET技術的建立分為兩個部分，即臨床部分和體外受精胚胎培養(yǎng)實驗室部分，分別承擔不同的工作，只有兩個部分高度默契配合才能有效完成這項技術的臨床實施。臨床部分主要任務是從需要接受IVF-ET治療的不孕婦女體內(nèi)取出成熟的（或經(jīng)體外培養(yǎng)后能夠發(fā)育成熟的）卵母細胞，以及把培養(yǎng)所得的胚胎移植回母體內(nèi)（子宮或輸卵管)。實驗室部分則是把卵和精子在體外建立的培養(yǎng)環(huán)境中實現(xiàn)受精，并把受精卵培養(yǎng)成有活力的早早期胚胎。嚴重少弱精癥導致的男性不育，則需要借助ICsI技術輔助受精，所以又把精卵混合培養(yǎng)受精稱為常規(guī)體外受精。按照不孕癥病因不同，因男性或女性因素引起的不孕或不育在接受助孕治療時需選擇不同的治療方式。按照我國衛(wèi)生行政管理規(guī)定，開展體外受精輔助生殖技術及其衍生技術目前主要包括體外受精/胚胎移植、配子/合子輸卵管內(nèi)移植或宮腔內(nèi)移植、卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射（intracyt。plasmicsperminjecti。n,ICsI)、植入前胚胎遺傳學診斷（preimplantati。ngeneticdiagn。sis,PGD)、卵子贈送、胚胎贈送等，均需要經(jīng)過衛(wèi)生行政部門的審批后才能開展。對這些機構的基本要求包括人員和技術能力、場地要求、專用基本設備等。第三節(jié)1VF.ET適應證隨著IVF-ET技術的不斷完善和普及，這項技術目前幾乎成為不孕癥治療的最后一張王牌，從醫(yī)療實踐中需警惕技術濫用和盲目擴大適應證，但是當經(jīng)過一定診治過程后認為無法自然懷孕的時候，常常會轉向借助IVF-ET技術，幾年來IVF-ET的適應證在逐漸擴大。適應證選擇是IVF-ET技術得以合理應用的關鍵，對于有適應證的患者夫婦還要評估其身體一般狀態(tài)和生育力狀態(tài)，當身體健康狀態(tài)（健康體檢和傳染病排查）適合并能夠承受妊娠和分娩，且生育力評估后認為具備實施IVF-ET最基本要求時，可以啟動IVF-ET助孕治療后續(xù)流程。一、常規(guī)體外受精技術適應證1.輸卵管堵塞或功能障礙引起精卵運輸障礙導致的不孕在IVF技術出現(xiàn)之前，輸卵管因素引起的不孕主要通過輸卵管成型術復通輸卵管或期待治療，IVF技術為輸卵管因素不孕提供了直接針對病因的治療方法和較好的療效。2.子宮內(nèi)膜異位癥伴不孕內(nèi)膜異位癥常常伴有不孕，當輸卵管通暢時，期待療法、促排卵或促排卵人工受精、甚至宮腹腔鏡手術處理等均為常用的治療方法。但是當這些治療未能見效時，可以選擇IVF助孕。對Ⅲ、N期內(nèi)膜異位癥來說，在盡可能清除病灶的同時，可能造成卵巢卵細胞池的消耗，影響IVF助孕時的成功率。一項對內(nèi)異癥不孕的回顧性研究結果顯示，手術治療后9個月的妊娠率24%，而在同時期內(nèi)接受兩次IVF助孕的累計妊娠率達70%。3.男性輕度少精、弱精癥當妻子不孕，男方精液分析呈現(xiàn)一些精液參數(shù)不正?；蚰承┲笜擞休p度下降時，經(jīng)過體外分離技術處理后，精子總數(shù)和活力可達到進行常規(guī)IVF所需要的數(shù)量，這種情況下IVF技術可作為一種治療選擇。對嚴重的少弱畸精子癥通常采用卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射（intracyt。plas-micsperminjecti。n，ICsI)技術輔助受精。4.原因不明的不孕不明原因性不孕是指經(jīng)過包括腹腔鏡在內(nèi)的不孕癥病因排查仍不能找出不孕癥病因時所做的診斷。一般發(fā)生率在10%-20%，一些夫婦在診療或期待過程中成功自然受孕。不明原因多年未孕的夫婦有些會嘗試IVF助孕，雖然從整體的臨床妊娠率上看，這些夫婦與輸卵管因素不孕夫婦助孕結局無異，但其發(fā)生完全受精失敗的幾率高于輸卵管因素不孕夫婦，提示其精子或卵母細胞有潛在異常的可能性，對常規(guī)受精失敗的夫婦借助ICsI技術有望成功受精和得到可以懷孕的胚胎，說明自然受精障礙可能是部分夫婦的不孕病因。5.排卵功能障礙性不育最常見的排卵障礙是多囊卵巢綜合征（PC0s)，經(jīng)過數(shù)周期成功誘導排卵仍未受孕或誘發(fā)排卵困難，反復促排卵失敗時，控制性卵巢刺激和IVF可作為另一個治療選擇。雖然越來越多的證據(jù)證明IVF對治療PC0s不孕的有效性，但也同時存在發(fā)生0Hss風險大的問題，應給予高度重視。部分PC0s婦女還存在促排卵周期卵泡發(fā)育不良的傾向，卵泡生長極緩慢或在發(fā)育過程中發(fā)生退化，這些病例可以嘗試未成熟卵體外成熟培養(yǎng)技術（inyitramaturati。n,IVM)，從直徑在10mm以下的竇卵泡內(nèi)取出未成熟卵母細胞，經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)后行常規(guī)IVF或ICsI受精，在適應證選擇合適，實驗室和臨床技術成熟穩(wěn)定的情況下，可期待20%-30%的臨床妊娠率。6.其他因素引起的不孕IVF技術也可適用于如免疫性不孕，年齡因素引起的生育力下降，癌癥患者生育力儲備等情況。二、卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射（ICsI)技術適應證對嚴重的少、弱、畸精子癥、梗阻性無精子癥、生精功能障礙造成的精液中無精子，但在睪丸活檢組織中能分離出精子的情況下，ICsI技術是行之有效的助受精技術，ICsI受精的胚胎有與自然受精形成的胚胎相似的發(fā)育潛力。嚴重少弱精癥生精障礙的男性，約10%存在染色體和性異常，對這些病例進行ICsI之前要先進行染色體核型分析。嚴重少弱精子癥精液中分離的精子，阻塞性無精子癥附睪抽吸獲得的精子，生精嚴重低下男性睪丸組織中分離出的精子均可用于ICsI,并獲得較滿意的受精率。另外，對男性免疫性不育、有常規(guī)體外受精失敗史和精子結構異常，如無頂體或頂體功能異常等也可使用ICsI技術助受精。ICsI技術是通過顯微操作，將一條精子注射到一個成熟的卵母細胞細胞質內(nèi)，從而輔助完成受精過程。針對男性因素不育發(fā)展的ICsI技術在生殖領域內(nèi)應用愈來愈廣泛，其適應證也不再僅僅局限于少弱精癥。目前，ICsI的主要適應證有:①嚴重的少、弱、畸精癥。精液中有一定數(shù)量活力及形態(tài)良好的精子是保證常規(guī)受精的前提，如果精液質量較差，選擇ICsI是最佳治療方案，因為ICsI技術只要保證每枚成熟卵子有一條質量較好的精子即可。②不明原因的常規(guī)受精失敗史。對于既往IVF存在常規(guī)受精失敗或受精率低于20%時，當病人再次進行IVF治療，通常建議此周期采用ICsI技術。③睪丸或附睪精子。對于一些需要通過手術從睪丸或附睪中獲取的精子，ICsI技術也能幫助這些男性利用較少的精子完成受精過程。④需要用PCR技術診斷的PGD周期。由于單細胞PCR技術難度大，準確性要求高，為了為避免PCR擴增時因顆粒細胞或精子導致的污染，針對PCR-PGD周期應采用ICsI技術。第四節(jié)控制性促排卵與卵泡監(jiān)測一、常用控制性促排卵方案目前常用的控制性卵巢刺激方案分為GnRH激動劑降調節(jié)方案和GnRH拮抗劑方案。GnRH激動劑降調節(jié)方案又按照使用激動劑起始時間不同分為長方案，即前一月經(jīng)周期黃體中期開始使用降調節(jié)藥物。短方案是從同周期月經(jīng)第2天開始使用降調節(jié)藥物，直至HCG日。超短方案是從同周期月經(jīng)第2天開始使用降調節(jié)藥物，3d后停用。在月經(jīng)來潮的第2天抽血測定基礎FsH、LH、E、P水平，當這些激素水平在基礎狀態(tài)，B超檢查卵巢內(nèi)沒有0.8cm直徑的卵泡時，可以開始使用促性腺激素，一般劑量為每日150-300U。年齡在35歲以下，B超探測卵巢中基礎竇卵泡較多時從低劑量開始使用，年齡在35歲以上，基礎竇卵泡少，基礎FsH升高者，采用較高劑量起始。拮抗劑方案是從月經(jīng)周期第2-3天開始每日用促性腺激素150-300U,自使用促性腺激素第5-8天起，每天同時使用GnRH拮抗藥0.25mg,直至HCG日仍需要使用。GnRH-a長方案:從黃體中期開始使用GnRH-a。此時由于內(nèi)源性雌二醇和黃體酮水平較高，垂體處于生理抑制狀態(tài)，此時給GnRH-a一般不會造成促性腺激素的短暫升高，但有時仍會使黃體期延長。因此，長方案是利用GnRH-a對垂體的短暫促進作用消失，垂體處于抑制狀態(tài)后，完全用外源性促性腺激素刺激卵巢。一般認為，在月經(jīng)來潮2-4d后即可開始使用促性腺激素（或血雌二醇測定證明卵巢處于抑制狀態(tài)時)，直到卵泡發(fā)育成熟使用HCG日為止，HCG使用后34-36h取卵。使用GnRH-a長方案時，需適當增加促性腺激素的用量，每日用量為3-4支（每支75U)，可多達每日6支。另外，為能完全有計劃的安排取卵手術時間，可在用GnRH-a兩周后的任何時間開始給予促性腺激素。GnRH-a長方案是目前IVF-ET中應用最多的促排卵方案，約占70%。GnRH-a短方案:從月經(jīng)周期第1-3天起使用GnRH-a,利用GnRH-a使垂體釋放內(nèi)源性促性腺激素的作用促進卵泡發(fā)育，使用2-3d后開始使用促性腺激素，注射HCG日停止使用GnRH-a。短方案可減少促性腺激素用量和使用時間，降低治療費用。但偶爾GnRH-a對前一周期黃體起到喚醒或挽救的作用，孕酮水平升高甚至形成黃體囊腫。這種情況需放棄本次周期治療。GnRH-a超短方案:GnRH-a開始時間與短方案相同，連續(xù)使用3d止，也有報道認為連續(xù)使用7天能更有效地抑制LH峰提前出現(xiàn)。GnRH拮抗劑方案:不需要事先降調節(jié)，促排卵周期中卵泡發(fā)育到一定大小時應用GnRH拮抗劑抑制內(nèi)源性LH峰，避免提前排卵。近10年來拮抗劑方案因簡單方便易控，在IVF卵巢刺激方案中占到的比重越來越大。二、控制性促排卵方案中常用藥物及作用1.降調節(jié)或拮抗內(nèi)源性LH峰的藥物（1）促性腺激素釋放激素激動藥（GnRH-ag。nist,GnRH-a）:GnRH-a對促性腺激素釋放激素（GnRH）受體有更高的親和力，更為持久占據(jù)大部分的受體，使垂體的促性腺激素釋放激素受體大量損失并得不到補充，因而垂體不能對內(nèi)源性或外源性的GnRH進一步發(fā)生反應。使用GnRH-a一段時間后垂體的LH和FsH分泌顯著減少，呈藥物去垂體狀態(tài)，這種現(xiàn)象被稱為垂體的降調節(jié)。這種垂體抑制作用是可逆的，可隨停藥而恢復。在超排卵中使用GnRH-a有如下優(yōu)點。①抑制早發(fā)LH峰的發(fā)生，避免其對卵子的質量的不良影響;②降低血漿內(nèi)的LH水平，對基礎LH水平增高的多囊卵巢綜合征的病人尤為合適;③GnRH-a用藥初期，受藥物作用影響出現(xiàn)一個短暫的血漿促性腺激素高峰，有刺激小竇卵泡生長的作用;GnRH-a分為短效制劑和長效制劑，短效制劑劑量為100mg/支，一般每日1次，每次1支，連續(xù)用藥8-10d垂體達到降調水平，以后每日用藥維持至HCG日停用。長效制劑劑量為3.75mg/支，為緩釋制劑，注射1支藥維持有效血藥濃度28-30d，我國生殖領域用長效制劑較為普遍，并且根據(jù)經(jīng)驗常用半劑或1/3劑等作降調使用。（2）促性腺激素釋放激素拮抗藥（GnRH-antag。nist,GnRH-ant):可與GnRH受體結合，但不產(chǎn)生信號的轉導，從而阻斷GnRH對垂體的作用。目前應用于輔助生殖臨床的拮抗劑有Centr。relix和Ganirelix兩種。GnRH拮抗劑的作用特點是:①與垂體GnRH受體竟爭性結合;②使用后立即產(chǎn)生抑制效應，降低Gn和性激素水平;③它的抑制效果呈劑量依賴型;④停藥后垂體立刻恢復反應性。GnRH拮抗劑，每支劑量25ug,從卵泡直徑10mm或13mm以后開始，每日注射1次，每次1支拮抗劑，HCG日也要注射。2.人促性腺激素HMG和促卵泡素FsH生理狀態(tài)下，每個月經(jīng)周期卵巢中都有一批卵泡自發(fā)的進人早期發(fā)育狀態(tài)，這種卵泡的自然募集過程大約是從前一個周期的最后一周開始，所能募集的卵泡數(shù)目與卵巢中剩余的原始卵泡中的卵母細胞數(shù)成正比，后者與婦女的年齡關系密切。受藥物刺激后開始發(fā)育的卵泡數(shù)目與自然募集的卵泡數(shù)相關，這些卵泡對FsH較敏感。因此，在決定發(fā)育卵泡的數(shù)目方面，年齡比FsH的使用劑量更為重要。個體對FsH的反應在一定時期是比較恒定的，可根據(jù)刺激周期E2峰值分為高反應和低反應兩種類型，高反應者獲得卵母細胞的數(shù)目和妊娠的機會均高于低反應者。要預測卵巢的反應性，可在月經(jīng)初期測定血清FsH水平，如果內(nèi)源FsH水平在較高水平（20U/ml)，說明卵巢已處于絕經(jīng)前狀態(tài)，對促性腺激素反應差。最初的IVF-ET是利用自然周期取卵，但每個周期只能得到一個卵。為了提高妊娠率，目前在實施IVF-ET技術時，多采用控制性卵巢刺激法獲得多個卵母細胞，使用促性腺激素釋放激素激動藥或者拮抗藥避免卵泡成熟時內(nèi)源性LH峰出現(xiàn)造成提前排卵，給予超生理劑量人類促性腺激素，使一次促排卵周期能有多個卵泡發(fā)育，獲得多個可用于受精的卵母細胞，以獲得較多可移植的胚胎。在實施控制性卵巢刺激促超排卵過程中，須每日或間斷用陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育數(shù)目、大小，同時監(jiān)測血中雌二醇水平，血或尿LH變化，以便適時調整用藥，當雙側卵巢中有2或3個較大卵泡直徑達到18mm直徑時，確定卵泡成熟，給予5000-10000UHCG一次性注射，HCG后36h，發(fā)育好的卵泡中卵母細胞核成熟，此時應該安排收獲取卵在促排卵技術用于IVF治療的最初階段，氯米芬和人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG）聯(lián)合是最常用的方案，應用這種方案比自然周期增加了獲卵數(shù)。HMG是從絕經(jīng)后婦女尿中提取的促性腺激素，每支含有75UFsH和75ULH。人重組促性腺激素r-FsH自1993年以后陸續(xù)開始在世界各地的IVF促排卵方案中廣泛應用，其具有不含LH、高純度、劑量和生物活性穩(wěn)定等特點，利用基因工程工廠化生產(chǎn)，且藥品來源充足。促性腺激素給藥劑量因個體卵巢儲備狀態(tài)不同而異，對卵巢儲備好的年輕女性（30歲以下)，或者有多囊樣卵巢時，日用藥劑量，特別是起始劑量應在150U或以下;而對年齡在38歲以上，基礎FsH升高卵巢儲備較差的病例，日用藥量或起始劑量可在300U或以上。在卵泡監(jiān)測過程中如果發(fā)現(xiàn)被刺激生長的卵泡數(shù)不足或生長緩慢時，可適當增加促性腺激素劑量，而當刺激出的卵泡數(shù)目過多時，應適當減少用藥量，降低發(fā)生卵巢過度刺激綜合征的風險。3.絨毛膜促性腺激素HCG一般來說，當B超監(jiān)測到兩側卵巢中有3個以上卵泡達到18mm直徑以上時，提示卵泡已發(fā)育至排卵前狀態(tài)，為誘發(fā)卵泡中卵母細胞細胞核減數(shù)分裂開始，一次性注射HCG5000-10000U,HCG可替代排卵前內(nèi)源性LH峰，使卵母細胞恢復減數(shù)分裂，并在用藥后36h左右處于第二次減數(shù)分裂中期，此時的卵母細胞即稱之為成熟卵母細胞，具備了與精子結合受精的功能。在拮抗劑方案中，也可使用GnRH-a對垂體的激動作用，觸發(fā)垂體迅速大量釋放LH,誘導卵母細胞成熟。三、促排卵周期卵泡發(fā)育的監(jiān)測1.實時超聲觀察卵泡發(fā)育超聲觀察在監(jiān)測卵泡發(fā)育過程中起到重要作用，可同時觀察卵泡的大小和數(shù)目，特別是陰道超聲的使用大大方便了醫(yī)生和患者，具有簡單、直觀、可靠等特點。從月經(jīng)周期第8天左右開始每日或隔日觀察一次，測定并記錄發(fā)育卵泡的數(shù)目、直徑以及子宮內(nèi)膜的發(fā)育情況。在使用促性腺激素促排卵時，當2個以上卵泡直徑達到16mm以上，可作為卵泡發(fā)育成熟的一項重要指標，此時子宮內(nèi)膜厚度至少應在8mm以上。超聲監(jiān)測作為一種聲像學檢查，對其結果應當進行鑒別分析，可利用動態(tài)觀察的辦法鑒別小囊腫和發(fā)育中的卵泡，但有時小囊腫也隨月經(jīng)周期或受藥物刺激而長大，必要時結合雌二醇水平進行鑒別，也可在卵泡早期或前一周期的黃體后期做一次超聲檢查，排除小囊腫存在。2.血清雌二醇測定血清雌二醇（E2）水平取決于卵泡大小和發(fā)育卵泡的數(shù)目。隨著卵泡發(fā)育，顆粒細胞產(chǎn)生的雌激素增加，當最大卵泡直徑達18mm,且血清雌二醇水平達到平均每個卵泡直徑15mm時為500pm。l,要考慮注射HCG誘導排卵，E2水平達3000mU/L以上，B超顯示多個卵泡發(fā)育時，取卵后發(fā)生嚴重的卵巢過度刺激綜合征風險增加，需要警惕，必要時可采取全胚胎凍存措施，避免發(fā)生遲發(fā)型中、重度卵巢過度刺激綜合征。第五節(jié)取卵術和精子采集一、B超引導下穿刺抽吸卵泡取卵超聲引導下行經(jīng)陰道取卵是指在陰道超聲探頭引導下經(jīng)陰道穿刺抽吸卵泡取卵，這項技術是1983年首先由Gleicher等開始使用的（圖18-2)。目前陰道超聲取卵已取代腹腔鏡取卵成為最常用的取卵方式。取卵時，患者采取截石位，用生理鹽水沖洗陰道或先用含碘溶液沖洗，然后再用生理鹽水沖洗。有些情況下還可在取卵術前后用抗生素預防感染。陰道取卵所使用的超聲探頭一般為高頻陰道探頭（7MHz)，帶有穿刺引導支架。穿刺針內(nèi)徑120-140um,穿刺針尖部鋒利，且在靠近針尖部經(jīng)過特別加工處理，超聲下清晰可見此處回聲增強。穿刺針沿著針導進入，抽吸卵泡負壓100-120mmHg,當針尖位置在卵泡中心且隨著卵泡液吸出卵泡塌陷說明穿刺準確，旋轉針頭有助于徹底吸空卵泡，必要時可用培養(yǎng)液沖洗卵泡1次或2次。一個卵泡抽吸完畢后，穿刺針可繼續(xù)向前穿刺鄰近卵泡。每次取出穿刺針后都要用培養(yǎng)液抽吸沖洗穿刺針和管道系統(tǒng)，常有卵和凝血塊存留其中。超聲引導下經(jīng)陰道穿刺取卵具有簡便、快捷，不用全身麻醉和并發(fā)癥少等優(yōu)點，但仍有可能發(fā)生出血，器官損傷（膀胱、腸管、骼血管等)，以及術后感染等危險。因此在穿刺時必須肯定該結構是在卵巢輪廓之內(nèi)，且從三維徑線上看是球形結構。卵巢和卵泡深藏于盆腔內(nèi)，如何在排卵前將卵取出曾經(jīng)困擾著這項技術的開展。當已經(jīng)掌握了哺乳動物體外受精技術的Edwards教授遇到了婦科內(nèi)鏡技術專家stept。e教授時，碰撞出的利用腹腔鏡微創(chuàng)技術取卵的火花，成就了人類歷史上的一個醫(yī)學奇跡，第一例試管嬰兒由此誕生。陰道B超引導下卵泡穿刺取卵術是目前最常用的取卵方式。取卵術前可使用鎮(zhèn)痛劑或采用靜脈麻醉讓患者在無痛苦狀態(tài)下結束穿刺取卵術。一般情況下穿刺兩側卵泡取卵可在約10min內(nèi)完成，B超引導下卵泡穿刺取卵術簡便易行、痛苦小、創(chuàng)傷小、易接受、可以多次進行等特點，對IVF技術的普及應用起到了有力的推動作用。經(jīng)陰道超聲取卵可采用局麻和鎮(zhèn)靜劑或使用短效靜脈麻醉劑，后者必須同時開放靜脈直到取卵結束麻醉恢復后才能讓病人離院。麻醉中要密切監(jiān)測患者生命體征，盡量避免各種麻醉并發(fā)癥的發(fā)生。所謂穿刺取卵手術，實為穿刺抽吸卵泡液，抽出的卵泡內(nèi)容物送至IVF實驗室，在實體顯微鏡下從卵泡液中收集卵冠丘復合物。取卵手術前，IVF實驗室需要了解每一個病人并核對其詳細資料，書寫采卵記錄單，在患者清醒時與患者核對夫妻雙方姓名和女方出生年月日等。卵泡抽吸取卵時抽出的卵泡液為草黃色清亮液體，當混合少量血液時變?yōu)榧t色，其中懸浮一些細胞團塊或有透明狀黏液。將卵泡液倒人圓皿中，肉眼可辨認直徑約3-5mm的透明狀黏液團，其中針尖大小的白點即為卵冠丘復合物（0C)。如肉眼未發(fā)現(xiàn)0C,需要在低倍顯微鏡下仔細辨認和尋找。由于卵母細胞很容易受到溫度、pH以及滲透壓等變化的影響，受外界環(huán)境的變化損傷卵母細胞將呈現(xiàn)出受精障礙或影響受精后胚胎的活力，因此需要快速的將采集到的0C轉移至預先準備好的培養(yǎng)皿中，置于5%或6%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。卵母細胞的質量可以通過顆粒細胞、卵丘放射冠形態(tài)以及卵子的形態(tài)等方面來評估。倒置鏡下還可以觀察到不同時期卵子的特點。GV期卵母細胞胞質內(nèi)可見生殖泡，GV期的卵子不具備受精能力。MI期卵子生殖泡消失，但沒有排出第一極體，MI期卵子如能體外成熟，可以受精。MⅡ期卵子是卵子的成熟時期，鏡下可見第一極體，此期卵子受精率高。二、精子采集女方取卵同時或取卵后2h內(nèi)安排男方取精，取精前應該需禁欲3-5d。取卵日男方手淫方式取精，精液放人"無菌無毒"的專用取精杯中。取出的精液立即傳人相應的精子實驗室，實驗室人員要認真核對夫婦姓名后接受標本和進行精子分離處理。處理前精液在室溫下要液化30min后進行處理精液。處理精液的目的是去除精漿，集中活動的精子并使之獲能。常用的精液處理方法有上游法和密度梯度離心法。處理后的精子調整好密度后，以每個卵子對應10萬-50萬條精子的比例進行受精。對于少弱精癥患者或手術獲取精子的患者需要通過ICsI技術實施受精過程。正常精液在分離后可得到數(shù)百萬或千萬個以上活精子，可用于實施常規(guī)體外受精。嚴重少弱精患者分離出的活動精子少，需要通過卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射輔助受精。三、手術取精對于阻塞性無精子癥，或嚴重生精障礙可從睪丸曲細精管中分離出精子患者的，借助經(jīng)皮睪丸穿刺或附睪穿刺法取精，抽出的附睪液或睪丸組織在實驗室進行處理，分離出精子。睪丸或附睪中得到的精子一般不足以進行常規(guī)受精，需借助卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射受精。第六節(jié)體外受精和胚胎評估將取到的卵泡液注人培養(yǎng)皿，肉眼快速辨認含卵細胞及其外周的透明帶、放射冠的卵冠丘復合物。在解剖鏡下確認有卵細胞存在后，轉移至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)已預置受精培養(yǎng)液并在C02培養(yǎng)箱平衡過夜，找到的卵在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h，按每1ml受精培養(yǎng)液含有10萬左右活動精子的濃度進行受精，經(jīng)過用培養(yǎng)液洗滌離心上游等過程分離出的精子是已經(jīng)被誘導完成獲能過程的精子，在分離出的精子數(shù)量和質量符合常規(guī)受精標準時，采取精子和卵混合培養(yǎng)的受精方式，這種方式受精更符合生理狀態(tài)下精子和卵自然選擇的過程。當男方為嚴重少弱畸精子癥患者，或者是手術獲取的睪丸或附睪精子時，需要采取卵母細胞胞質內(nèi)單精子注射輔助受精。另外，當精液精子分離不滿意，或有過常規(guī)受精失敗史的夫婦，也可選擇單精子注射受精的方式。體外受精后16-18h觀察有無原核形成，并更換卵裂期培養(yǎng)液。對于常規(guī)受精的卵子需要吹打去除顆粒細胞才能觀察到原核。正常受精可以看見卵子中有兩個相同大小的圓形結構，即雌雄原核。同時還可以在卵周隙觀察到第二極體。近年來有學者利用原核評分評估胚胎發(fā)育潛能。在觀察受精時，通常會遇見無原核出現(xiàn)或僅見單個原核出現(xiàn)的情況，甚至有時還會有多個原核出現(xiàn)的情況。無原核出現(xiàn)或出現(xiàn)單原核的情況不一定意味著受精失敗，有可能為孤雌激活、延遲受精或者是雌雄原核出現(xiàn)不同步等情況。多精子受精后可以觀察到3個或3個以上原核，這樣的胚胎不能用于移植。目前胚胎的選擇仍然以形態(tài)學評估應用最為廣泛。形態(tài)學特征對胚胎質量的評價見表18-1。表18-1體外受精人早期胚胎質量評價分級形態(tài)特征細胞碎片1分裂球大小均等，透亮無2分裂球大小不均10%3分裂球大小不均10%-50%4分裂球大小不均50%體外受精后胚胎在第5天時發(fā)育到囊胚期，隨著體外培養(yǎng)體系的完善，特別是專供囊胚培養(yǎng)的培養(yǎng)液的使用，囊胚培養(yǎng)和移植受到推崇，囊胚移植有利于進一步行胚胎選擇。如果有優(yōu)質囊胚形成，囊胚移植可得到更好的臨床妊娠率，選擇性單囊胚移植更能夠在最大限度減少多胎的情況下，保持較滿意的臨床妊娠率。第七節(jié)胚胎移植（embry。transfer,ET)取卵后第2-3天卵裂球期胚胎和第5-6天的囊胚期胚胎都可進行胚胎移植。囊胚移植比較符合自然受精胚胎進入子宮的時間，且在現(xiàn)有體外培養(yǎng)條件下，能發(fā)育至囊胚說明胚胎具有生命力，移植成功率高。一次移植的胚胎數(shù)以2枚或3枚為宜。我國相關規(guī)定，35歲以下病人，第一次接受IVF-ET治療時移植2個胚胎，年齡大或反復不成功的病例，最多移植3個胚胎。增加胚胎移植數(shù)，妊娠率雖略有增加，但多胎率卻會隨之顯著增加。為減少多胎妊娠帶來的危害，推薦選擇性單囊胚移植，有較高的妊娠率，又可以降低多胎率。在早期胚胎發(fā)育過程中，透明帶逐漸變薄;擴張的囊胚使得透明帶進一步變薄，進而突破透明帶，囊胚孵出，然后完成著床過程。透明帶結構或者功能異常時，均會影響卵子受精和胚胎發(fā)育以及著床等過程。這種情況下可在胚胎移植前借助透明帶打孔或削薄等輔助孵化技術幫助胚胎孵出和著床。輔助孵化技術是否能幫助胚胎孵出，仍存爭議，應嚴格把握輔助孵化適應證。較為公認的適應證有:高齡患者（40歲以上)、透明帶增厚、數(shù)次胚胎移植未妊娠（3次以上）的患者等。胚胎移植是用專用移植管裝載要移植的胚胎，經(jīng)陰道從宮頸口送人子宮內(nèi)的過程，提高移植者的熟練度和技巧有助于獲得更好地臨床結局，移植管進入子宮腔后釋放胚胎的位置應在距宮底部10-15mm處，B超引導下移植也許有助于更準確的觀察移植位置。IVF的成功應是獲得單胎妊娠并分娩。胚胎能否著床取決于胚胎質量及子宮內(nèi)膜的容受性。胚胎移植的目的是將胚胎安全的運送到子宮腔內(nèi)。胚胎移植前，移植醫(yī)師和實驗室人員以及護士都要認真核對夫婦姓名，避免因疏忽導致的嚴重錯誤。將移植后剩余的分裂球期胚胎或者囊胚期可移植胚胎要進行冷凍保存，凍存胚胎的常用方法有程序冷凍和玻璃化冷凍，保存在液氮中。第八節(jié)黃體支持和妊娠隨訪一、黃體支持由于控制性促排卵抑制內(nèi)源性LH分泌，抽吸取卵術時又將一定數(shù)量的卵泡顆粒細胞帶出，以及多個卵泡發(fā)育引起的雌孕激素比值不合理等，在IVF-ET后一般都采用添加黃體酮的方法進行黃體支持。目前可供選擇的黃體酮制劑有肌內(nèi)注射黃體酮，陰道內(nèi)使用的黃體酮凝膠或膠丸，口服黃體酮片等，使用劑量為肌內(nèi)注射黃體酮60mg/d，或雪諾酮凝膠90mg/d。黃體支持從取卵日開始，取卵術后當日即使用黃體酮，若該周期移植后未懷孕，在移植后2周經(jīng)過血HCG測定為陰性時可以停藥，如診斷懷孕后最好要用至移植后8-10周，無出血、腹痛等，應逐漸減量至停用。二、妊娠隨訪IVF-ET術后隨訪包括幾個方面，首先是妊娠隨訪，在移植后12-14d抽血查血中HCG水平，能診斷妊娠則要繼續(xù)用藥1-2周后復查HCG,此時HCG又一次呈現(xiàn)數(shù)倍甚至數(shù)十倍上升，移植后4周以上B超上可看到宮內(nèi)正常發(fā)育的胚胎的原始胎心管搏動，診斷為活胎宮內(nèi)妊娠。于中孕期，最好還有一次隨訪，了解妊娠進展情況，分娩后隨訪要了解分娩孕周、新生兒出生體重、身長、有無畸形等，對于孩子出生后健康狀態(tài)、智力、體能、身體發(fā)育等都應該是IVF-ET后出生嬰兒的長期觀察隨訪項目。臨床妊娠率或分娩率是目前評估IVF-ET技術實施后是否獲得療效的最重要的指標。但是，因IVF-ET后是否能夠獲得生育子女機會在很大程度上受女方年齡，生育力儲備等因素的影響。治療后的妊娠率在年輕的預后好的病例中可期待40%-50%的活嬰率。而在年齡大、不孕原因復雜、卵巢儲備差以及存在子宮容受性差等問題的病例，雖經(jīng)過嚴格的調整治療，臨床妊娠率和獲得活嬰的機會仍然很低。雖然已經(jīng)有很大的提高，但總體來說，目前IVF-ET治療后的活嬰分娩率為25%-35%。IVF-ET后懷孕的病例中自然流產(chǎn)發(fā)生率在10%左右、而且宮外孕的風險較大，特別是容易存在宮內(nèi)宮外合并妊娠或宮外多部位妊娠等復雜情況，在妊娠隨訪檢查中，要特別謹慎。多胎妊娠是IVF-ET后又一妊娠高危因素，鑒于多胎妊娠帶給母嬰的多重危險，生殖領域近年來越來越多的主張進行選擇性單胚胎移植。第九節(jié)人類生育力的冷凍保存隨著生殖技術的不斷發(fā)展，配子和胚胎的低溫保存技術已經(jīng)成為IVF-ET領域中常規(guī)技術之一。一、人類胚胎冷凍保存和復蘇技術IVF治療過程中，由于應用了促排卵藥物，在一個周期內(nèi)可以獲得數(shù)個卵母細胞，受精后可以獲得數(shù)個胚胎;一次移植可以使用2枚或3枚胚胎，那么將剩余的胚胎凍存，可以最大程度保護患者的利益。隨著囊胚培養(yǎng)技術逐漸成熟，囊胚冷凍近年來發(fā)展迅速。二、人類配子及性腺組織體外保存（生殖儲備）技術精子冷凍包括精液精子冷凍、睪丸或附睪精子冷凍、睪丸組織冷凍等。精液精子冷凍技術簡單穩(wěn)定，對于一些無精癥患者來說，在手術活檢睪丸或附睪診斷是否有生精功能的同時，可以將存在精子患者的組織或精子冷凍，待日后IVF治療時使用;這樣既減輕了患者的痛苦，又提高了這些患者的精子利用率。另外，對于一些年輕的惡性腫瘤患者在放化療前凍存精液，可以保存其生育力。卵子凍融技術是近年來生殖領域研究的熱點。雖然胚胎凍融技術已經(jīng)十分成熟，但是一些特殊的情況，例如取卵日無法獲得精子、宗教信仰問題、卵子庫建立等均需要凍存卵子。卵子是人類最大的細胞，凍存過程中容易形成冰晶導致細胞損傷致使復蘇率降低。目前針對卵子的凍存主要應用玻璃化凍存技術凍存MⅡ期卵母細胞。卵子在凍存前需要剝除顆粒細胞。隨著腫瘤治療的進展，許多惡性腫瘤患者生存期得到了大幅度的提高。但是在惡性腫瘤治療的過程中，放、化療都不可避免地會損傷性腺組織。對于男性患者來說，可以凍存精液保存其生育力，對于年輕女性腫瘤患者來說，除了可以保存卵子、胚胎，還可以凍存卵巢組織。由于凍存卵巢組織比凍存配子或胚胎復雜得多，因而目前臨床上尚未廣泛開展。

第3章體外受精-胚胎移植及其衍生技術第一節(jié)體外受精.胚胎移植技術體外受精-胚胎移植技術，包括培養(yǎng)基的準備、卵子的收集、精液的處理、體外受精操作、胚胎培養(yǎng)、胚胎評估以及選擇和移植等技術。一、常規(guī)體外受精（一）培養(yǎng)液的準備培養(yǎng)基是卵子體外發(fā)育成熟以及完成受精和胚胎發(fā)育的主要環(huán)境，在37℃C02培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)基可以為卵子提供一個恒定的溫度和pH,同時為卵子提供必要的營養(yǎng)物質。依據(jù)不同的發(fā)育階段使用的培養(yǎng)液主要有受精液、卵裂期培養(yǎng)液、囊胚培養(yǎng)液和移植液。目前商品化培養(yǎng)基有很多種，使用時要依據(jù)培養(yǎng)基的要求設置C02培養(yǎng)箱的C02濃度，以維持胚胎發(fā)育的適宜pH,目前所用的大多數(shù)培養(yǎng)液，需要用5%-7%的C02平衡使培養(yǎng)液的pH達到7.20-7.45的水平。但胚胎培養(yǎng)液中的碳酸和碳酸氫鹽緩沖體系不一定是唯一左右培養(yǎng)液pH的系統(tǒng)，培養(yǎng)液中還存在其他的共輒酸堿對共同參與緩沖系統(tǒng)的平衡。不同批號的同一培養(yǎng)基pH也可能存在差異，單獨這個差異可能不足以影響胚胎的發(fā)育，但如果因為培養(yǎng)箱C02濃度的偏移加大了這個差異或是加上其他因素，綜合起來就會損傷胚胎的發(fā)育潛能。胚胎自身調節(jié)pH的能力是有限的，細胞外pH（pHe）的變化會對細胞造成應激，細胞內(nèi)pH（pHi)變化影響酶的活性、膜的轉運、蛋白的合成、糖酵解、關鍵的代謝以及細胞的分裂、分化。鼠胚pHi從7.25降至7.1時，可導致胎鼠的體重和身長降低。為方便跟蹤每個胚胎的發(fā)育情況，目前采用的培養(yǎng)多是微滴式單胚胎培養(yǎng)，亦即將液體制備成20-50ul的微滴，每個微滴培養(yǎng)一枚胚胎。為防止微滴液體的揮發(fā)而引起滲透壓的變化，可采用礦物油覆蓋培養(yǎng)基，覆蓋礦物油還可以減少體外操作時溫度和pH的波動范圍，建立一道介于培養(yǎng)液滴與外界環(huán)境的屏障，減少空氣中塵粒及細菌污染，同時維持液滴的三維空間。但也研究認為礦物油會吸收液體內(nèi)一些脂溶性因子，向液體內(nèi)擴散一些不明但可能影響到胚胎發(fā)育的有害物質。礦物油也可能存在一些不明的有毒物質會影響正常發(fā)育，如保存條件等都會增加這種可能性。為減少礦物油自身可能帶來的潛在危害，也有人認為礦物油經(jīng)培養(yǎng)基洗滌過濾后更有利于胚胎的體外發(fā)育，清洗過程有利于去除水溶性毒素物質，因此礦物油在使用前進行質量控制試驗是十分必要的。為了培養(yǎng)液得到充分的平衡，達到胚胎發(fā)育所需的pH,一般在使用的前一天下午準備培養(yǎng)液微滴，使其隔夜平衡。培養(yǎng)基完全平衡需要的時間因培養(yǎng)基的體積以及有無油覆蓋而不同，研究發(fā)現(xiàn)覆蓋油的50ul的培養(yǎng)基需要8h才能完全平衡。（二）卵母細胞的采集與評估1.試劑與耗材（1）卵泡沖洗液:具有緩沖能力的培養(yǎng)基，主要用于卵泡抽吸系統(tǒng)，取卵時卵泡以及卵丘復合體的沖洗。（2）礦物油:覆蓋用于體外操作的液體或體外培養(yǎng)的液滴。（3）受精液:存放收集的卵冠丘復合體