丙泊酚對(duì)成年大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的影響

丙泊酚對(duì)成年大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的影響[目的]丙泊酚作為手術(shù)和無痛診療中最常使用的靜脈麻醉藥物,除了其麻醉特性外,文獻(xiàn)報(bào)道其還具有神經(jīng)保護(hù)、發(fā)育神經(jīng)毒性作用。本研究從分子水平探討丙泊酚對(duì)于成年大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,NSCs)增殖分化的影響,并進(jìn)一步探討丙泊酚對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,以期揭示海馬NSCs增殖分化的保護(hù)方法及探索患者因麻醉因素引起的腦損傷的保護(hù)、治療方法。[方法]細(xì)胞研究對(duì)象選擇原代培養(yǎng)海馬NSCs,經(jīng)不同濃度的丙泊酚(0、5、50、1OOμM)處理24h后,選擇不同位點(diǎn)觀察比較各濃度處理后的神經(jīng)球直徑以及運(yùn)用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide,MTT]方法檢測(cè)干細(xì)胞活力。動(dòng)物研究對(duì)象選擇成年雄性Sprague-Dawley大鼠,連續(xù)5天,每天一次腹腔注射丙泊酚30mg/kg(Prop30組)、丙泊酚60mg/kg(Prop60組)、丙泊酚120mg/kg(Prop120組)以及6mL/kg生理鹽水(N組)、6mL/kg脂肪乳劑(V組)構(gòu)建模型。Morris水迷宮(Morriswatermaze,MWM):以檢測(cè)丙泊酚對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,包括定向航行能力(逃避潛伏期)及空間探索能力(穿臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間百分比)。免疫熒光染色(immunofluorescencestaining,IF):Nestin與Ki67雙熒光標(biāo)記,計(jì)數(shù)成年大鼠海馬齒狀回Nestin+Ki67+細(xì)胞,以觀察丙泊酚對(duì)海馬齒狀回NSCs的增殖影響;β-TubulinⅢ熒光染色,計(jì)數(shù)β-TubulinⅢ+細(xì)胞,觀察海馬區(qū)域神經(jīng)發(fā)生;Nestin與Notch3雙熒光標(biāo)記,以定位Notch3蛋白表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timequantitativepolymerasechainreaction,qPCR)和蛋白免疫印跡法(westernblotting,WB):檢測(cè)丙泊酚對(duì)海馬Notch3mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)影響。運(yùn)用WB檢測(cè)海馬Hes1、Hes5蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。[結(jié)果]1.MWM訓(xùn)練中各組大鼠的逃避潛伏期總體上均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與N組比較,V組和Prop60組的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Prop120組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),Prop30的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng);在穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限時(shí)間百分比上,V組、Prop30、Prop60組與N組比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但Prop120組的記憶能力較N組的減退。2.在成年大鼠體內(nèi),與N比較,Prop60組海馬齒狀回Nestin+Ki67+細(xì)胞數(shù)明顯增多,Prop120組Nestin+Ki67+細(xì)胞數(shù)顯著減少。在體外培養(yǎng)的海馬NSCs,與丙泊酚OμM比較,丙泊酚50μM處理后的神經(jīng)球直徑明顯增大。雖然丙泊酚100μM處理后的神經(jīng)球和丙泊酚0μM的比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是神經(jīng)球直徑有減小的趨勢(shì)。與丙泊酚0μM的細(xì)胞活力比較,丙泊酚50μM處理后組的MTT值明顯增高,丙泊酚100μM處理后的MTT值降低。3.與N組比較,Prop60組的β-TubulinnⅢ+細(xì)胞數(shù)增多,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且Prop120組的β-TubulinⅢ+細(xì)胞數(shù)較N組的減少。4.丙泊酚連續(xù)腹腔注射5天后,成年大鼠海馬齒狀回的NSCs表達(dá)Notch3蛋白。Prop60組的Notch3蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量較N組的明顯增高,Prop120組的Notch3蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量與N組的比較雖有下降趨勢(shì),但其表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.檢測(cè)腹腔注射丙泊酚的成年大鼠海馬Notch信號(hào)通路靶基因Hes1、Hes5的表達(dá),Hes1的基因及蛋白表達(dá)差異未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與N組比較,Prop60組的Hes5表達(dá)明顯增高,Prop120組的Hes5表達(dá)量減少。[結(jié)論]1.連續(xù)腹腔注射丙泊酚會(huì)損傷成年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。2.60mg/kg劑量的丙泊酚對(duì)成年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力損傷