還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的非吞噬細(xì)胞氧化酶研究進(jìn)展

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的非吞噬細(xì)胞氧化酶研究進(jìn)展

此外，還原性二羥磷酸鈉（nadh）還原于許多生物的反應(yīng)中，并對(duì)身體具有重要意義。然而，nadh氧化突變是細(xì)胞中一個(gè)重要的氧化蛋白。在最初的研究中，人們注意到納德什峰葡萄酸鹽2的異質(zhì)結(jié)。這是由壓力不可接受的第2個(gè)準(zhǔn)分酸酶（準(zhǔn)分酸酶2，編號(hào)no2）引起的?？缒喖谆酵?、亞甲基磷酰胺、p7pho、p40pho和三級(jí)磷酰胺（guanosynietp）酶合物1（ras-reflection1，rap1）、ras-cyboronesbilite2，rac2）、ras-ras（ras-reflectioncyclopedia2，rac2）、ras-ras（ras-reflectioncyclopedia2，rac2）、細(xì)胞分裂率蛋白質(zhì)42（ras-cychsen狀cyse，cd2）和p29氧化酶組成的酶建筑群（pi）。這些酶建筑群由活動(dòng)氧（ros）清除入侵細(xì)胞的致病性微生物，并參與主導(dǎo)防御。NADPH氧化酶的催化亞基gp91phox及其同系物-非吞噬細(xì)胞氧化酶1(non-phagocyticcelloxidase1,Nox1),非吞噬細(xì)胞氧化酶3(non-phagocyticcelloxidase3,Nox3),非吞噬細(xì)胞氧化酶4(non-phagocyticcelloxidase4,Nox4),非吞噬細(xì)胞氧化酶5(non-phagocyticcelloxidase5,Nox5),雙功能氧化酶1(dual-functionoxidase1,Duox1)和雙功能氧化酶2(dual-functionoxidase2,Duox2)被稱為非吞噬細(xì)胞氧化酶(non-phagocyticcelloxidase,NOX)家族。最近研究發(fā)現(xiàn):NADPH氧化酶NOX蛋白家族分布于內(nèi)皮、血管平滑肌等許多非吞噬細(xì)胞中,NOX家族蛋白的主要生物學(xué)功能是產(chǎn)生ROS,以維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。但在異常狀態(tài)下,如機(jī)體受到環(huán)境中的超細(xì)顆粒(ultrafineparticles,UFPs)、生長因子[如表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)]、血小板衍生因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)、細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)]、炎癥介質(zhì)[白介素(interleukin,IL)]、鈣離子(Ca2+),以及重金屬、部分藥物等刺激時(shí),NOX家族蛋白異常表達(dá)或激活,產(chǎn)生大量的ROS,參與誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、腫瘤、炎癥以及老年癡呆癥等疾病的發(fā)生和進(jìn)展。因此,對(duì)NOX家族致病機(jī)制的研究在臨床疾病的預(yù)防、診斷、治療中有重要的意義。1端和疏水跨膜區(qū)n末端的電泳分析NOX蛋白結(jié)構(gòu)的特異性決定了家族各成員的活化、功能等差異,7個(gè)成員根據(jù)其蛋白分子的結(jié)構(gòu)不同分為3組:第1組由Nox1~Nox44個(gè)NOX蛋白組成,它們的蛋白分子包括兩大結(jié)構(gòu)域,即部分伸向胞漿的C末端和疏水跨膜區(qū)N末端,其中C末端包含有NADPH-和FAD-結(jié)合位點(diǎn);N末端有6個(gè)保守的跨膜區(qū),也叫跨膜α單環(huán),其中在第3個(gè)和第5個(gè)跨膜區(qū)各有2個(gè)結(jié)合亞鐵血紅素的保守組氨酸殘基;Nox5被單獨(dú)列為第2組,除了包含Nox1~Nox4的結(jié)構(gòu)域外,還在N末端有4個(gè)EF手結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是鈣離子(Ca2+)的結(jié)合位點(diǎn);NOX家族蛋白的第3組是Duox氧化酶,它不僅包含Nox1~Nox5的結(jié)構(gòu)域(與Nox5不同的是有2個(gè)EF手結(jié)構(gòu)),而且還在N末端有1個(gè)髓過氧化物酶(myeloperoxidaseenzymeproperties,MPO)樣胞外域,即第7個(gè)跨膜區(qū),因此也叫雙功能氧化酶。2活化亞基n-q-rac,p40p只有當(dāng)NOX家族蛋白亞型與跨膜亞基和胞漿亞基結(jié)合,并組裝成有活性的復(fù)合體后才能發(fā)揮其生物學(xué)功能,其中胞漿亞基向胞膜的遷移并與NOX蛋白的結(jié)合是NOX蛋白復(fù)合體活化的基礎(chǔ)。不同的細(xì)胞亞基在NOX酶復(fù)合體組裝及活化的過程中發(fā)揮不同的作用,其中p22phox是膜結(jié)合亞基,它不僅參與了NOX蛋白的固定,而且也發(fā)揮了招募胞質(zhì)亞基p67phox,p47phox,p40phox和胞質(zhì)小分子GTP酶結(jié)合蛋白R(shí)ac的作用。p67phox的N末端具有分別與小分子GTP酶結(jié)合蛋白R(shí)ac和p40phox結(jié)合的區(qū)域,從而誘導(dǎo)了Rac和p40phox向細(xì)胞膜的遷移,故稱為活化亞基。p47phoxC末端的脯氨酸富集區(qū)(prolinerichregion,PRR)可以和p67phox末端的Src同源3結(jié)構(gòu)區(qū)(Srchomology3,SH3)結(jié)合,發(fā)揮募集胞質(zhì)亞基p67phox,p40phox和Rac的作用,因此也被稱為組織亞基。p40phox的吞噬細(xì)胞氧化酶區(qū)(phagocyticcelloxidation,PX)與膜磷脂緊密結(jié)合,在Nox2的活化過程中發(fā)揮招募蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用。機(jī)體在大量刺激因子,如補(bǔ)體片段(C5a)、白三烯B4、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)等的刺激下,NADPH氧化酶胞質(zhì)亞基p47phox發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致其構(gòu)象改變,分子間的緊密結(jié)合打開,自動(dòng)抑制區(qū)(auto-inhibitoryregionaut,AIR)被釋放,同時(shí)SH3區(qū)和PX區(qū)暴露出來,接著p67phox利用其C末端的SH3區(qū)結(jié)合p47phox的PRR區(qū),即實(shí)現(xiàn)了磷酸化的p47phox攜帶p67phox,p40phox和Rac靠近胞膜,最后利用N末端暴露的SH3區(qū)與伸向胞質(zhì)中的p22phox的PRR區(qū)結(jié)合,最終實(shí)現(xiàn)了胞膜亞基與胞質(zhì)亞基在細(xì)胞膜上的集合與裝配,最后在胞膜上形成有活性的NADPH氧化酶復(fù)合體。3ros的來源NADPH氧化酶的主要生物學(xué)功能是產(chǎn)生ROS,通過該途徑產(chǎn)生的ROS主要參與了機(jī)體宿主防御及體內(nèi)多條信號(hào)通路的調(diào)控。ROS是氧衍生的小分子物質(zhì),包括超氧化物、羥自由基、過氧化氫和一些既是氧化因子又能夠很輕易的轉(zhuǎn)換成自由基的物質(zhì)如次氯酸、臭氧及單態(tài)氧等。生物體內(nèi)ROS的來源有線粒體、細(xì)胞色素P450、過氧化物酶類體系、黃嘌呤氧化酶、一氧化氮(nitricoxide,NO)合成酶及NADPH氧化酶體系等,其中吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶是最早被確認(rèn)的產(chǎn)生ROS的體系。吞噬細(xì)胞的NADPH氧化酶在靜息細(xì)胞中沒有活性,在病原微生物、炎癥介質(zhì)、外界因子等的刺激下活化產(chǎn)生ROS,參與了機(jī)體的宿主防御;而非吞噬細(xì)胞的NADPH氧化酶,即NOX家族蛋白不同于吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶,它們?cè)谡r(shí)保持一定的活性,產(chǎn)生胞內(nèi)胞外的ROS,通過此途徑產(chǎn)生的ROS并不主要起細(xì)胞防御功能,而是作為“信號(hào)分子”和“基因表達(dá)開關(guān)”參與了細(xì)胞分化、增殖、凋亡(細(xì)胞內(nèi)源性的ROS)及細(xì)胞間信號(hào)通路的調(diào)控(細(xì)胞外源性的ROS)等,從而參與了機(jī)體多數(shù)器官生理功能的調(diào)控;當(dāng)受到胞外刺激因子的刺激時(shí),NOX家族蛋白過表達(dá),產(chǎn)生更高濃度的ROS,誘導(dǎo)了人體疾病的發(fā)生、發(fā)展。4ros的表達(dá)在血管病理刺激因子、生長因子、炎癥介質(zhì)、鈣離子、UFPs及藥物等的刺激下,機(jī)體內(nèi)NOX蛋白過表達(dá),產(chǎn)生過量的ROS形成氧化脅迫,誘導(dǎo)了心血管疾病、腫瘤、炎癥、糖尿病腎病及肺部疾病的發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn),機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的許多疾病可能與ROS過量誘導(dǎo)的氧化壓力相關(guān)。在多數(shù)情況下,ROS的過量產(chǎn)生則歸因于NOX蛋白或是NADPH氧化酶亞基的過表達(dá)。4.1nox源性ros在心血管疾病中的作用高膽固醇血癥、吸煙、衰老、糖尿病和高血糖病是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子,有證據(jù)顯示:血管炎癥和血管內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用。以前認(rèn)為在心血管系統(tǒng)中表達(dá)的NOX蛋白亞型有3種,即Nox1,Nox2和Nox4,但最近的研究發(fā)現(xiàn)Nox5在血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá),并可能參與了血管的病變過程。NOX家族蛋白在心血管系統(tǒng)中可能參與了血管緊張度、內(nèi)皮細(xì)胞的生長分化以及氧傳感等生理過程的調(diào)節(jié),但表達(dá)異常的NOX家族蛋白誘導(dǎo)了血管內(nèi)皮功能的障礙、內(nèi)皮細(xì)胞的肥大、遷移、凋亡以及血管的發(fā)生和重塑等。動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)炎癥性疾病,由NADPH氧化酶NOX家族亞型的活化和動(dòng)脈硬化危險(xiǎn)因子的介入共同誘導(dǎo),組織缺氧、多不飽和脂肪酸、炎癥細(xì)胞因子和機(jī)械性損傷等刺激血管,激活了血管外膜成纖維細(xì)胞中的NOX蛋白,產(chǎn)生過量的ROS。同時(shí)鈣離子激活Nox5,產(chǎn)生過量的ROS加速了內(nèi)皮舒張因子活性形式NO的降解,并抑制了內(nèi)皮細(xì)胞NO合成酶的活性,通過有活性的NO的減少而導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,增加了動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。也有研究顯示:NOX源性的ROS通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的生成而介導(dǎo)了動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈血管的發(fā)生,因?yàn)閂EGF可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊微血管的形成。高血壓是一種多因素誘發(fā)的疾病,是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管收縮性增強(qiáng)、血管結(jié)構(gòu)重塑和血管炎癥等病理過程相互作用的結(jié)果。NOX源性的ROS調(diào)節(jié)了與受體交聯(lián)相關(guān)的信號(hào)通路[絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)、蛋白酪氨酸激酶]和血管緊張素-Ⅱ(angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)介導(dǎo)的鈣離子通道的活化,從而參與了血管改變;另一方面超氧陰離子(O2-)可以使內(nèi)皮舒張因子NO失活,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙,以及過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)對(duì)血管重塑的調(diào)節(jié)等,共同促進(jìn)了高血壓的發(fā)生。心血管系統(tǒng)中NOX源性的ROS是心臟內(nèi)壓力反應(yīng)的重要參與者,在調(diào)控心肌肥大、凋亡、纖維化以及線粒體功能障礙中發(fā)揮主要的作用,最終的病理結(jié)果是誘導(dǎo)了心力衰竭的發(fā)生。心肌肥大是心力衰竭發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子,Nox2在α-腎上腺素能激動(dòng)劑、Ang-Ⅱ和TNF-α的刺激下活化,產(chǎn)生過量的ROS參與了心肌肥大的調(diào)控;Nox4也可能是調(diào)節(jié)病理性肥大和氧化壓力的關(guān)鍵分子,所以它們可能是心力衰竭治療的重要靶點(diǎn)。4.2nox4源性ros在腫瘤治療的作用機(jī)制腫瘤的發(fā)生常伴有多種基因的異常表達(dá),NOX家族蛋白的過表達(dá)是許多腫瘤細(xì)胞的特征之一,其中ROS在腫瘤形成的各個(gè)階段發(fā)揮了重要作用,比如說在不同腫瘤中具有特異性表達(dá)的ROS參與了腫瘤早期階段基因突變和DNA異常修飾而引起的DNA損傷;在腫瘤的發(fā)展階段,ROS通過對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié),促進(jìn)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤血管的生成、細(xì)胞凋亡的抑制等;在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中,氧自由基可能通過增加細(xì)胞的遷移速率增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力等。與腫瘤相關(guān)的NOX亞型具有特異性,結(jié)腸癌中生長因子(growthfactor,GF)激活受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase,TRK),通過Ras-有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogenactivedkinase,MEK)-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellar-regulatedkinase,ERK)-GATA結(jié)合蛋白(GATAbindingprotein,GATA-6)通路誘導(dǎo)了NOX1的過表達(dá),而Nox1源性的ROS參與了細(xì)胞的有絲分裂,并觸發(fā)“血管生成開關(guān)”,誘導(dǎo)了VEGF的分泌,最終促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管的生成,進(jìn)而反向地促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。在有些腫瘤中NOX蛋白為細(xì)胞提供了抗凋亡信號(hào),如胰腺癌中Nox4源性的ROS調(diào)節(jié)了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族-細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1(serine/threoninekinasefamily-apoptosissignalregulatingkinase1,AKT-ASK1)存活信號(hào)通路而抑制了胰腺癌細(xì)胞的程序性死亡。在巴雷特食道癌腫中,Nox5源性的ROS可能增強(qiáng)了細(xì)胞的存活率。因此,NOX家族蛋白的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能是一個(gè)相互作用的過程。4.3nox蛋白亞型及相關(guān)致病機(jī)制炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng),一般包括兩個(gè)階段,第一階段為急性炎癥,主要通過自身免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié),持續(xù)的時(shí)間較短,一般對(duì)機(jī)體是有利的;第二階段為慢性炎癥,是由于大量的致炎因子的反復(fù)刺激或是急性炎癥反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致的組織受損而引起的,致炎因子包括持續(xù)的氧化壓力、細(xì)菌和真菌感染、變應(yīng)原、輻射及化學(xué)藥品等,其中NOX蛋白源性的ROS產(chǎn)生的氧化壓力所誘導(dǎo)的慢性炎癥與癌癥、糖尿病和心血管、神經(jīng)學(xué)及肺部疾病等在內(nèi)的多數(shù)慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。與炎癥相關(guān)的NOX蛋白亞型包括Nox1,Nox2,Duox1和Duox2。Nox1的mRNA在結(jié)腸上皮細(xì)胞中有豐富的表達(dá),受LPS和鞭毛蛋白等炎癥介質(zhì)刺激時(shí),Nox1過表達(dá),產(chǎn)生過量的ROS可以激活多種轉(zhuǎn)錄因子,活化的轉(zhuǎn)錄因子反過來促進(jìn)了生長因子,炎癥細(xì)胞因子IL-1/IL-6和IL-11,炎癥趨化因子IL-8,抗炎因子等細(xì)胞因子類基因的轉(zhuǎn)錄,又加劇了炎癥反應(yīng)。持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)是癌癥形成的隱形殺手,比如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎等炎性腸疾病是發(fā)生結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素之一,慢性胰腺炎與胰腺癌的發(fā)生也是密切相關(guān)的。慢性肉芽腫疾病是由于Nox2或其調(diào)節(jié)亞基p22phox,p47phox和p67phox中任一一個(gè)突變或者缺失而導(dǎo)致的,病人表現(xiàn)出免疫功能缺陷、對(duì)感染高度敏感的癥狀,并且極易患炎性腸道疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。Duox1和Duox2在氣道上皮細(xì)胞內(nèi)分別受到IL-4,IL-13,IL-1a,IL-1b及干擾素-r的誘導(dǎo),參與了炎癥刺激引起的組織損傷的修復(fù)等。慢性血管炎是炎癥持續(xù)的條件下,血管壁中NOX源性的ROS誘導(dǎo)的氧化壓力產(chǎn)生的結(jié)果,會(huì)導(dǎo)致血管的重塑和血管疾病的發(fā)生,例如組織缺氧、炎性細(xì)胞因子的刺激或者機(jī)械性損傷存在時(shí),肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞中NOX4源性的ROS生成增多,促進(jìn)了肺動(dòng)脈血管的重構(gòu)和肺動(dòng)脈高血壓的發(fā)生、發(fā)展。4.4ros用量與呼吸道毒性的關(guān)系過量的ROS誘導(dǎo)的氧化壓力影響了機(jī)體多數(shù)器官的生理作用,導(dǎo)致了機(jī)體器官功能受損或是功能障礙。腎肥大和細(xì)胞外基質(zhì)的堆積是糖尿病腎病的早期特征,ROS調(diào)節(jié)了系膜細(xì)胞中Ang-Ⅱ介導(dǎo)的信號(hào)通路和蛋白的合成,參與了腎肥大和細(xì)胞外基質(zhì)的重建,最終誘導(dǎo)了糖尿病腎病的發(fā)生,而Nox4是這一過程中ROS的主要來源。在肺成纖維細(xì)胞或是平滑肌細(xì)胞內(nèi)中,轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowth