低氧誘導(dǎo)的gf-3表達(dá)調(diào)控作用的研究

低氧誘導(dǎo)的gf-3表達(dá)調(diào)控作用的研究

營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞最初發(fā)育于低氧環(huán)境。這是克服貧困的關(guān)鍵。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體的一種轉(zhuǎn)錄因子,與特定的靶基因結(jié)合,激活靶基因,使細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。TGF-3β是一種多功能細(xì)胞因子,滋養(yǎng)細(xì)胞的TGF-3β表達(dá),與滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和分化有關(guān),調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)功能。本文研究低氧條件下,體外培養(yǎng)的BeWo細(xì)胞HIF-1α及TGF-3β表達(dá)的變化,以及應(yīng)用反義核苷酸封閉HIF-1α后,低氧對(duì)TGF-3β表達(dá)的影響,以探討缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)功能的影響及HIF-1對(duì)TGF-3β表達(dá)的調(diào)控作用。1材料和方法1.1免疫調(diào)節(jié)體的制備DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司。鼠抗人HIF-1α和TGF-3β單克隆抗體,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自SantaCruse公司。Trizol購(gòu)自Gibcol公司。MAV、隨機(jī)引物購(gòu)自Promega公司。HIF-1α的反義及正義寡核甘酸由上海生工生物公司合成。HIF-1α、TGF-3β及內(nèi)參β-actinPCR引物、TaqMan探針均由上?；倒竞铣伞６縋CR反應(yīng)體系為ABI公司產(chǎn)品。1.2細(xì)胞培養(yǎng)和材料制備孕早期的絨毛組織取自第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科門診,共8例,孕6～8周,經(jīng)電動(dòng)負(fù)壓吸引術(shù)結(jié)束妊娠。絨毛經(jīng)無菌PBS液沖洗后,移入無菌臺(tái)內(nèi),去除胎膜組織及蛻膜組織,取成簇的小絨毛部分(約50g)。加少許DMEM培養(yǎng)液,絨毛組織剪成0.5～1mm3小塊,接種到6孔培養(yǎng)板中,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12h,開始缺氧實(shí)驗(yàn)。絨毛組織分4組培養(yǎng),正常對(duì)照組:細(xì)胞在正常培養(yǎng)液、常氧濃度下培養(yǎng)48h;缺氧組:細(xì)胞在正常培養(yǎng)液、低氧條件下培養(yǎng)48h;HIF-1α反義組:培養(yǎng)液加入HIF-1α反義寡核甘酸(10μmol/L)、低氧條件下培養(yǎng)48h;HIF-1α正義組:培養(yǎng)液加入HIF-1α正義寡核甘酸(10μmol/L)、低氧條件下培養(yǎng)48h。HIF-1α寡核甘酸為全硫代修飾,反義寡核甘酸序列為:5′-GCCGGCGCCCTCCAT-3′,正義寡核甘酸序列為:5′-ATGGAGGGCGCCGGC-3′。低氧裝置為可調(diào)式培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司產(chǎn)品),將絨毛組織放入可調(diào)式培養(yǎng)箱中,由進(jìn)氣孔充入低氧混合氣體(5%CO2、2%O2、93%N2)20ml/min,30min后密閉,在37℃條件下培養(yǎng)。48h后收集絨毛組織,-80℃保存。HIF-1α的反義及正義寡核甘酸序列和濃度,低氧濃度及缺氧時(shí)間參照Caniggia等報(bào)道。1.3rna的純化、鑒定和pa-igodt的表達(dá)取絨毛組織約100mg,加入到裝有1ml預(yù)冷的Trizol液的勻漿器中充分勻漿后,移入1.5ml離心管中。于室溫靜置10min后,加入0.2ml氯仿振蕩,再于室溫下靜置15min,于4℃、以12000g離心15min。取上層水相加于新的離心管中,加入等體積的異丙醇搖勻,室溫靜置10min,于4℃、以12000×g離心10min。棄上清,加750ml/L乙醇1ml,離心(同前)5min。取沉淀物干燥后,用20μlDEPC水浴解,用紫外分光光度計(jì)鑒定RNA的純度并計(jì)算其濃度。其余置-20℃保存?zhèn)溆?。?0μl的反轉(zhuǎn)錄體系,包括總RNA樣品2.5μl(含RNA2μg)、oligodT引物2μl、RNA酶抑制劑0.5μl(含20U)、5×buffer5μl(含dNTP)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μl及DEPC水9.5μl。PT-PCR的條件為:70℃5min,42℃3min,42℃60min,72℃5min。cDNA產(chǎn)物置-20℃保存。1.4檢測(cè)tgf-3方法mRNA水平的定量PCR檢測(cè)HIF-1α基因上游引物的序列為:5′-ATCAGCTATTTGCGTGTGAGGA-3′;下游引物為:5′-TCTGTGCTTTCATGTCATCTTCAAT-3′。檢測(cè)HIF-1α所用探針序列為:5′-CAAATCACCAGCATCC-3′。TGF-3β基因上游引物為:5′-CGGAATGAGCAGAGGATCGA-3′;下游引物為:5′-GCTGTTTGGCAATGTGCTC-3′;檢測(cè)TGF-3β所用探針序列為:5′-CTTCCAGATCCTTCGGC-3′。采用50μlABI體系,包括:10×TaqManbufferA5μl、25mmol/LMg2+10μl、10mmol/LA1μl、10mmol/LC1μl、10mmol/LG1μl、20mmol/LU1μl、TaqGold0.5μl、AmpEraseUNG0.5μl、上游引物(20μmol/L)0.5μl、下游引物(20μmol/L)0.5μl、TaqManprobe(50μmol/L)5μl及多聚酶(5U/μl)0.25μl,加去離子水至50μl。采用ABI7700全定量PCR儀檢測(cè)。PCR循環(huán)參數(shù)為:50℃2min,95℃10min,95℃15s,60℃1min,共50個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照以三蒸水代替多聚酶加入擴(kuò)增體系,以β-actin作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR,計(jì)算機(jī)軟件(PEBiosystermsanalysissoftware)分析各反應(yīng)的熒光強(qiáng)度得出反應(yīng)的CT值并繪制β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出目的基因的相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。目的基因mRNA=目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參拷貝數(shù)。1.5sds電泳取絨毛組織約100mg,冷BPS洗滌2次,加入預(yù)冷的裂解液1ml(含亮肽酶、抑肽酶和胃蛋白酶抑制劑各0.1mg/L),置勻漿器中充分勻漿,于室溫靜置30min,于4℃、以12000×g離心10min。取上清,采用Bio-Rad法定量蛋白。取20μg總蛋白,加入等體積的樣品緩沖液,于100℃作用5min,進(jìn)行50～80g/L或50～120g/L不連續(xù)SDS分離。電泳完畢后,在Bio-RodMini濕式轉(zhuǎn)移電泳槽中,于冰浴中以100V、250mA電移2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,將硝酸纖維素膜于30g/L的BSA液中,于4℃封閉過夜。依次加入1∶200鼠抗人HIF-1αmAb或1∶200鼠抗人TGF-3βmAb,4℃過夜,洗滌及加1∶1000HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,室溫下孵育1h。洗滌,以DAB顯色后,照相。圖像經(jīng)掃描后,用LabWork3.0UVP軟件分析條帶的面積和灰度。蛋白含量=條帶面積×平均灰度。1.6統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,統(tǒng)計(jì)方法采用單因素的方差分析,組間比較采用LSD法。2結(jié)果2.1pcr檢測(cè)結(jié)果HIF-1α和TGF-3β蛋白Westernblot條帶見圖1,定量PCR熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)PCR循環(huán)數(shù)的曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2、3。HIF-1α和TGF-3β蛋白及mRNAPCR結(jié)果見表1。與對(duì)照組相比,缺氧組HIF-1α和TGF-3β蛋白,HIF-1α和TGF-3βmRNA表達(dá)均明顯增加,均有顯著意義(P<0.05)。2.2白及mrna表達(dá)變化與HIF-1α正義組比較,HIF-1α反義組HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)明顯減少,相差均有顯著意義(P<0.05);與HIF-1α正義組比較,HIF-1α反義組TGF-3β蛋白及mRNA表達(dá)也下降,相差均有顯著意義(P<0.05)。3低氧誘導(dǎo)的分娩細(xì)胞tgf-3表達(dá)在胎盤形成的早期,滋養(yǎng)細(xì)胞是在低氧環(huán)境中發(fā)育。低氧可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)浸潤(rùn)性表型及其對(duì)子宮內(nèi)膜的浸入。孕8周后,隨著絨毛間隙血流的增加,滋養(yǎng)細(xì)胞周圍氧濃度升高,其浸潤(rùn)能力也增加。孕12周左右,滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力達(dá)高峰,浸入到子宮內(nèi)膜上1/3,深達(dá)子宮螺旋動(dòng)脈,導(dǎo)致小口徑的動(dòng)脈擴(kuò)張,最終建立起有效的胎盤血液循環(huán)。孕12周后,滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力明顯下降。滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力在時(shí)間和空間上都受到嚴(yán)格調(diào)控。多種細(xì)胞因子參與了對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)功能的調(diào)控,但TGF-β超家族成員在滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)功能的負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。人類TGF-β存在3個(gè)異構(gòu)體:TGF-1β、TGF-2β和TGF-3β。研究發(fā)現(xiàn),TGF-1β、TGF-2β和TGF-3β在孕12周前的胎盤中都有表達(dá),然而TGF-1β、TGF-2β在整個(gè)孕期胎盤中表達(dá)是均一的,只有TGF-3β表達(dá)呈現(xiàn)了嚴(yán)格的發(fā)育調(diào)節(jié)模型。孕早期,絨毛組織TGF-3β表達(dá)增加,在6～8周時(shí)表達(dá)高峰,孕9周后明顯下降。在時(shí)間上,滋養(yǎng)細(xì)胞TGF-3β表達(dá)高峰比浸滋滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)浸潤(rùn)表型變化一致。TGF-3β表達(dá)下降,滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的浸潤(rùn)型黏附分子(整合素α1β1)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低氧可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的絨毛組織TGF-3β蛋白及mRNA表達(dá)增加。HIF-1是由α和β兩個(gè)亞基組成的異二聚體結(jié)構(gòu)。HIF-1α是唯一可接受氧濃度變化調(diào)節(jié)的亞單位,它決定HIF-1的活性。低氧可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增加,與HIF-1β形成的異二聚體結(jié)構(gòu)的數(shù)量也增加。在正常氧濃度下,HIF-1α迅速被蛋白酶降解。HIF-1αmRNA在整個(gè)孕期胎盤中都有表達(dá),但孕早期變化明顯;HIF-1α蛋白表達(dá)隨孕期增加而下降。體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞,缺氧可誘導(dǎo)其HIF-1α蛋白表達(dá)及與DNA結(jié)合的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,低氧可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的絨毛組織HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)增加。TGF-3β是HIF-1的靶基因,TGF-3β與HIF-1α之間存在密切的關(guān)系。孕12周前,兩者在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)是平行的。孕5～8周,滋養(yǎng)細(xì)胞的HIF-1α和TGF-