分子印跡技術(shù)在食品中的應(yīng)用

分子印跡技術(shù)在食品中的應(yīng)用

分子印花技術(shù)（mit）1始于20世紀(jì)40年代。當(dāng)時(shí)，侯惠提出了抗抗體形成的理論，認(rèn)為抗抗體合成是以抗抗劑為模式的。1972年,Wulff研究小組制備出了分子印跡聚合物(MIPs)。MIPs具有選擇性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)環(huán)境的耐受性好和制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),目前已被應(yīng)用于膜分離［2－3］、傳感器［4］、色譜分離［5－10］、固相萃?。?1－16］、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)［17］等領(lǐng)域。近年來,隨著MIT的發(fā)展和研究,越來越多的人把MIT應(yīng)用到食品中藥物殘留的檢測(cè)。1MIT1.1交聯(lián)劑溶液制備在一定條件下,當(dāng)模板分子與功能單體接觸時(shí)形成某種可逆的復(fù)合物;加入交聯(lián)劑將其固定或“凍結(jié)”,得到高聚物;將模板分子抽提出來,聚合物中就形成了與模板分子在空間和結(jié)合位點(diǎn)上相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴,這樣的空穴對(duì)模板分子具有專一性識(shí)別作用。1.2功能單體對(duì)有機(jī)相的作用1.2.1模板分子大多數(shù)MIPs的模板分子具有強(qiáng)極性基團(tuán)和氫鍵基團(tuán)。合成MIPs時(shí),模板分子的用量對(duì)MIPs的性能有直接影響,最佳量常為總量的5%;此外,模板分子的溶解性和獲取難易程度對(duì)模板分子的用量有一定影響。1.2.2功能單體功能單體的選擇是由模板分子決定的,需要能與印記分子成鍵,并且在聚合反應(yīng)中與交聯(lián)分子處于恰好的位置才能鑲嵌其中。根據(jù)作用的形式,功能單體可分為兩類:1)共價(jià)鍵型,含有乙烯基。常用的功能單體有含乙烯基的硼酸、醛、胺、酚及含有硼酸酯的硅烷混合物等。2)非共價(jià)型,含有乙烯基和羧基。常用的功能單體有羧酸類(如甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸等)、磺胺類(如二丙烯酰胺-2甲苯-1-丙磺胺)、雜環(huán)弱堿類(如乙烯基吡啶、乙烯基咪唑)。1.2.3交聯(lián)劑交聯(lián)劑的作用是“固化”模板分子和功能單體形成的聚合物,在聚合時(shí)加入交聯(lián)劑有利于形成穩(wěn)定完整的“印記”位點(diǎn)。在有機(jī)相中常用的交聯(lián)劑是乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、二乙烯基苯;在水相中最常用的是N,N-亞甲基雙丙烯酰胺。1.2.4溶劑作用首先,能溶解聚合反應(yīng)中所有的試劑;其次,能促進(jìn)聚合反應(yīng),減小反應(yīng)過程中的干擾;再次,可以起到致孔劑的作用。目前,MIPs的制備多局限于低極性溶劑中,常用的溶劑有乙腈、氯仿和甲苯等;這是因?yàn)闃O性強(qiáng)的溶劑會(huì)干擾氫鍵的形成,降低模板分子與單體間的結(jié)合。2分子印跡聚合方法近年來,MIT應(yīng)用于藥物殘留檢測(cè)的研究越來越多,而分子印跡的聚合方法有多種,如本體聚合、分散聚合、懸浮聚合、沉淀聚合、原位聚合及表面印跡法等。本文按照藥物類型分為以下幾類。2.1回收率的測(cè)定四環(huán)素類抗生素是廣譜類抗生素,是我國(guó)使用最多的藥物添加劑,容易造成殘留量超標(biāo)的主要有四環(huán)素、土霉素、金霉素等。四環(huán)素類抗生素多使用非共價(jià)法(自組裝法),可以用強(qiáng)力霉素為模板分子,沉淀聚合成MIPs;吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),吸附效果好,具有特異吸附性且穩(wěn)定性良好。以其作為填料填充固相萃取小柱(SPE),可得到最大載樣量為0.4mg的固相萃取小柱［11－12］。X.L.Sun等［5］開發(fā)了一種新型分子印跡整體柱,可以在牛奶和蜂蜜中檢測(cè)到四環(huán)素。他們以甲基丙烯酸(MAA)為功能單體,EGDMA為交聯(lián)劑,甲醇為溶劑,環(huán)己醇、十二醇為混合致孔溶劑,采用原位聚合法制備;然后,用C18柱測(cè)定牛奶和蜂蜜中的6種四環(huán)素類抗生素(四環(huán)素、土霉素、米諾環(huán)素、金霉素、美他環(huán)素和強(qiáng)力霉素),結(jié)果蜂蜜樣品的回收率為73.3%~90.6%,奶粉樣品的回收率為62.6%~82.3%。王紅濤［4］聯(lián)合使用MIT與電化學(xué)技術(shù),用于檢測(cè)水體中的四環(huán)素,試驗(yàn)以電沉積鉑顆粒的鈦片(Pt/Ti)為基體,具有較高的選擇性和靈敏度;并用修飾材料是多壁碳納米管的分子印跡電極作為工作電極,研制出了一種四環(huán)素檢測(cè)儀。該檢測(cè)儀采用電流法檢測(cè),線性范圍為0.02~50mg/L,對(duì)四環(huán)素的檢出限為0.01mg/L,具有快速、靈敏、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),為四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)提供了一種新方法。當(dāng)模板分子結(jié)合率降低,可以選擇與模板分子化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的類似物作為虛擬模板。從金霉素和四環(huán)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式上可以看出,兩者只在苯環(huán)上差1個(gè)Cl,而包含相同數(shù)目和位置能與功能單體甲基丙烯酸產(chǎn)生非共價(jià)鍵的羥基。因此,選擇四環(huán)素作為虛擬模板分子合成對(duì)鹽酸金霉素有特異吸附的MIPs,將填充有MIPs的聚四氟乙烯管作為固相萃取柱,連接在八通閥上對(duì)鹽酸金霉素進(jìn)行萃取和預(yù)富集,最后測(cè)定雞肝臟中鹽酸金霉素含量,回收率均在95%以上［13］。2.2分子印跡固相萃取法大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在動(dòng)物體內(nèi)的代謝時(shí)間較長(zhǎng),會(huì)對(duì)食品的安全帶來隱患,常用的有紅霉素、泰樂菌素、替米考星等。采用分子印跡與溶膠-凝膠法,以紅霉素為模板分子,3-氨基丙基三甲氧基硅烷為功能單體,正硅酸四乙酯為致孔劑,可以合成印跡效果較好的印跡聚合材料,其回收率達(dá)到104.5%。而選擇含有丙烯腈成膜基和甲基丙烯酸的共聚物為膜材料,用非共價(jià)分子印跡法制備紅霉素MIPs,采用溶膠-凝膠法轉(zhuǎn)化成膜后,再用超聲振蕩溶劑萃取法洗脫模板分子得到了分子印跡膜,通過比較證明,制備的紅霉素MIPs膜對(duì)紅霉素分子具有優(yōu)異的選擇性［3－4］。分子印跡固相萃取(MISPE)法可用于從動(dòng)物肌肉樣品中富集和純化紅霉素。Z.H.Zhang等［14］以紅霉素為模板,丙烯酰基-β-環(huán)糊精和甲基丙烯酸為雙功能單體合成多壁碳納米管-MIPs,通過透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡和傅立葉變換紅外光譜等方法表征,表明這種MIPs對(duì)紅霉素具有高選擇性;然后又將多壁碳納米管-MIPs作為固相萃取的吸附劑,測(cè)得的加標(biāo)回收率為85.3%~95.8%。Y.Q.Zheng等［6］以泰樂菌素為虛擬模板分子,甲基丙烯酸為功能單體,EGDMA為交聯(lián)劑,氯仿為溶劑,通過本體聚合合成MIPs;然后又對(duì)MIPs的制備及固相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化,應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定飼料中替米考星殘留量,發(fā)現(xiàn)其對(duì)替米考星具有高選擇性。2.3胺類型的檢測(cè)磺胺類藥物屬于廣譜抗菌藥,是禽畜抗感染治療的重要藥物之一;種類較多,但其化學(xué)結(jié)構(gòu)比較近似,因此合成MIPs時(shí),大多數(shù)選擇甲基丙烯酸為功能單體,EGDMA或EDMA為交聯(lián)劑,乙腈作為溶劑和(或)致孔劑使用,偶氮二異丁腈為引發(fā)劑。司麗麗［15］制備出磺胺二甲嘧啶分子印跡整體固相微萃取棒,建立了磺胺二甲嘧啶的檢測(cè)方法,該方法具有較高的靈敏度和良好的重現(xiàn)性,適用于檢測(cè)痕量的磺胺二甲嘧啶及其類似物。甲氧芐氨嘧啶MIPs的合成有塊狀和球狀(通過懸浮聚合)兩種類型,S.G.Hu等［18］將2種類型的甲氧芐氨嘧啶MIPs作為固相萃取的吸附劑,通過比較在不同溶劑中對(duì)甲氧芐氨嘧啶的吸附發(fā)現(xiàn),塊狀MIPs比球體選擇性和吸附能力更好。由于三聚氰胺和甲氧芐啶的化學(xué)結(jié)構(gòu)中嘧啶環(huán)的局部結(jié)構(gòu)類似,張紅武等［7］以三聚氰胺為類模板分子,使用原位聚合法制備了對(duì)甲氧芐啶有識(shí)別作用的MIPs整體柱。該印跡整體柱對(duì)甲氧芐啶具有選擇性識(shí)別作用,而對(duì)如葉酸、甲氨蝶呤等具有類似局部結(jié)構(gòu)的藥物分子則無保留作用。此外,三聚氰胺對(duì)甲氧芐啶的測(cè)定無干擾。2.4浮動(dòng)物合成民ps的選擇性A.Beltran等［16］通過非共價(jià)分子印跡方法合成對(duì)阿莫西林具有選擇性的MIPs,回收率為75%,調(diào)整加標(biāo)濃度后,回收率下降為65%。將制備的MI-SPE與市售的固相萃取小柱進(jìn)行比較,其選擇性高,萃取效果較市售的固相萃取小柱好。X.Z.Shi等［8］采用水溶液懸浮聚合法合成氨芐西林MIPs微球。色譜分析發(fā)現(xiàn),模板和功能單體二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯的最佳比例是8∶1。MISPE檢測(cè)得到的氨芐西林色譜圖表明,基質(zhì)干擾幾乎可以忽視,它的加標(biāo)蜂蜜樣品的回收率均在89%以上。J.Cederfur等［19］采用本體聚合法合成青霉素的MIPs。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),選擇甲基丙烯酸和三羥甲基丙烷三丙烯酸甲酯合成的MIPs選擇性較好。在與其他青霉素類抗生素的交叉反應(yīng)性的研究中發(fā)現(xiàn),交叉反應(yīng)性低(青霉素Ⅴ為15%,氨芐西林為16%,阿莫西林為19%);萘夫西林、苯唑西林表現(xiàn)出了較低的交叉反應(yīng)性(<1%);而頭孢菌素類抗生素(cephapirin)和結(jié)構(gòu)非相關(guān)的抗生素(氯霉素、四環(huán)素、氨苯砜、紅霉素)交叉反應(yīng)小于0.01%。2.5恩諾沙星的檢測(cè)常用的喹諾酮類抗生素有恩諾沙星、二氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星等。MIPs的制備常選擇甲基丙烯酸/4-乙烯基吡啶作功能單體,EDMA/EGDMA作交聯(lián)劑。氟喹諾酮類藥物MIPs是選擇甲醇∶水(10∶3)為致孔溶劑合成的。研究MIPs對(duì)氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星和恩諾沙星)和喹諾酮類藥物(氟甲喹、惡喹酸)的選擇性識(shí)別能力時(shí)發(fā)現(xiàn),其有較高的選擇性,并能區(qū)分氟喹諾酮類藥物和喹諾酮類藥物。然后,使用MIP整體柱微萃取結(jié)合高效液相色譜熒光檢測(cè)牛奶樣品中的氟喹諾酮類藥物時(shí)發(fā)現(xiàn),回收率為92.4%~98.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.9%［9］。使用原位聚合法合成恩諾沙星MIPs,可以將其作為固相萃取的材料,用以HPCE分離方式建立的MISPE-HPCE方法檢測(cè)雞肉中恩諾沙星,結(jié)果恩諾沙星的檢出限為92.02μg/kg,定量限為336.04μg/kg,回收率為77.84%~86.52%［17］。還可以用甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯與模板恩諾沙星結(jié)合制備不銹鋼色譜柱,檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MIPs對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星有高度的特異識(shí)別能力,可以快速分離和測(cè)定雞蛋中恩諾沙星和環(huán)丙沙星［10］。3分子印跡和識(shí)別的技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)本文介紹了國(guó)內(nèi)外MIT應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)的一部分研究,其中關(guān)于抗微生物藥的研究較多,但還是存在很多藥物在聚合上的技術(shù)問題,這就需要科研工作者努力鉆研,攻克難關(guān)。今后的研究方向會(huì)側(cè)重于以下幾個(gè)方面:1)分子印跡過程機(jī)理及定量描述。分子印跡和識(shí)別過程的機(jī)理將從目前的定性和半定量描述向完全定量描述發(fā)展,