腸球菌對(duì)六種抗生素耐藥情況的檢測(cè)

腸球菌對(duì)六種抗生素耐藥情況的檢測(cè)

腸球菌是人體腸道的正常菌群。近年來,由于廣譜抗生素的大量使用,腸球菌作為條件致病菌所引起的感染率持續(xù)升高,尤其對(duì)于那些有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病和機(jī)體免疫力低下的患者,容易侵入體內(nèi)或易位,從而導(dǎo)致局部或全身感染。腸球菌對(duì)多種抗生素顯示不同程度的耐藥。1988年,耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin-ResisitantEnterococci,VRE)首次在英國倫敦分離得到。研究發(fā)現(xiàn),VRE有六種不同的基因型,分別為VanA、VanB、VanC、VanD、VanE和VanG。目前,我國已分離得到VanA、VanB及VanC三種基因型。為了解腸球菌對(duì)常用抗生素的耐藥性,并檢測(cè)VRE基因型,特對(duì)本院所分離得到的100株腸球菌進(jìn)行檢測(cè)及分析,報(bào)告如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1臨床標(biāo)本的發(fā)現(xiàn)來自2005年8月~2006年1月湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診和住院患者臨床標(biāo)本共計(jì)100份。其中包括尿液(34%),生殖道分泌物(29%),痰(8%),膽汁(9%),血液(4%),胸水(1%)以及其他分泌物(15%)。1.1.2參考推薦的細(xì)菌VanA、VanB、VanC1及VanC2四株VRE,購自中科院微生物菌種庫。1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC25923。1.1.4其他抗菌素氨芐西林(AMP10μg/片)、氨芐西林/舒巴坦(AMS20μg/片)、萬古霉素(VAN30μg/片)、替考拉寧(TEC30μg/片)、環(huán)丙沙星(CIP5μg/片)、慶大霉素(GEN10μg/片)及慶大霉素(GEN120μg/片)均系英國Oxoid公司產(chǎn)品。1.1.5培養(yǎng)基MH瓊脂購自杭州天和微生物制品公司,腦心浸液培養(yǎng)基自配。1.1.6cccactacct基因表達(dá)聚合酶、dNTPs、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物購自寶生物工程公司,PCR引物VanA、VanB、VanC1及VanC2由香港中文大學(xué)微生物學(xué)系惠贈(zèng)。各引物基因序列分別是VanA:5′-CAGCGGCCATCATACGG-3′,3′-GCTATTCAGCTGTACTC-5′;VanB:5′-GATGCGGAAGATACCGTGGCT-3′,3′-CATCGCCGTCCCCGAATTTCAAA-5′;VanC1:5′-CCTCCGCCATCATAGCT-3′,3′-GGTATCAAGGAAACCTC-5′;VanC2:5′-CGCAGGGACGGTGATTTT-3′,3′-CGCAGGGACGGTGATTTT-5′。1.1.7儀器Vitek2微生物鑒定系統(tǒng)(法國梅里埃);PCR擴(kuò)增儀(廈門安普利);電泳儀(上海西巴斯);紫外透射儀(北京六一)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1識(shí)別菌株所有實(shí)驗(yàn)菌株均按全國臨床檢驗(yàn)操作程序由Vitek2微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。1.2.2k-b紙片法挑取培養(yǎng)18~24h的菌落,用無菌生理鹽水稀釋至菌液濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?用無菌棉簽沾取適量菌液均勻涂布于10%的綿羊血平板(M-H),貼上藥敏紙片。于35℃孵育24h,用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑大小。K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。每批實(shí)驗(yàn)均用金黃色葡萄球菌ATCC25923作質(zhì)控。1.2.3慶大霉素低耐株的篩選分別用含量為10μg/片及120μg/片的慶大霉素藥敏紙片對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),如果10μg/片紙片抑菌環(huán)直徑≤12mm,并且120μg/片紙片抑菌環(huán)直徑≥10mm時(shí),被測(cè)菌株為慶大霉素低耐株;如果120μg/片紙片抑菌環(huán)直徑≤6mm時(shí),被檢測(cè)菌株則為HLGR株。1.2.4菌株生長鑒定采用ADSP法,挑取培養(yǎng)18~24h的菌落,用無菌生理鹽水稀釋至菌液濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?無菌吸取10μL菌液滴加于含6μg/mL萬古霉素的瓊脂平板上,35℃孵育24h。觀察有菌生長者為耐萬古霉素的腸球菌。每批實(shí)驗(yàn)用糞腸球菌ATCC29212作陰性對(duì)照,以四株VRE參考菌株作陽性對(duì)照。1.2.5pcr擴(kuò)增dntps法采用多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiplexPCR)定性試驗(yàn),檢測(cè)VRE的耐萬古霉素基因。細(xì)菌DNA提取:將細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基中,35℃搖床孵育過夜,取1.5mL菌液倒入eppendof管中,12000r/min離心6min,去上清,加入100μL裂解液,混勻,37℃孵育30min,100℃水浴2min后,加入等體積的Tris飽和重蒸酚和氯仿,混勻,12000r/min離心5min后,取上清備用。多重PCR反應(yīng)體積50μL,含8種(4對(duì))引物各10pmol,4種dNTPs各0.2mmol/L,1.5mmol/LMgCl2,KCl50mmol/L,Tris-HCl(pH8.3),甘油5%,模板3μL,1.2UTaqDNA多聚酶。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃1min,54℃1min,72℃1min,共30個(gè)循環(huán),最后一個(gè)循環(huán)延伸5min。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(2V/cm)。以DL2000Marker為分子量參照標(biāo)準(zhǔn),紫外透射儀上觀察結(jié)果。2結(jié)果2.1糞腸球形分布100株腸球菌以糞腸球菌和屎腸球菌為主,共97株(97.0%),其中糞腸球菌86株(86.0%),屎腸球菌11株(11.0%);鉛黃腸球菌2株(2.0%),鵪鶉腸球菌1株(1.0%)。2.2k-b紙脂肪法檢測(cè)出一株對(duì)萬古霉素耐藥的糞腸球菌NO.C8,其抑菌環(huán)直徑為12.2mm。2.3hlgr腸球形分離對(duì)100株腸球菌進(jìn)行了高濃度慶大霉素藥敏測(cè)試,共分離出54株HLGR腸球菌,分離率為54%;對(duì)100株腸球菌進(jìn)行了ADSP法篩選,共分離出3株VRE,分別是糞腸球菌NO.C8,屎腸球菌NO.1511,鉛黃腸球菌NO.2078,分離率為3.0%。2.4不同菌株vre的耐藥率及藥敏試驗(yàn)結(jié)果糞腸球菌和屎腸球菌,鉛黃腸球菌,鵪鶉腸球菌對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星等6種抗生素的耐藥性差異,見表2。慶大霉素低耐株與高耐株對(duì)其他抗生素的耐藥率:見表3。經(jīng)ADSP檢出的三株VRE對(duì)六種抗生素的藥敏情況:見表4。經(jīng)多重PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在三株VRE中,只有鉛黃腸球菌2078是VanC2基因陽性,其余兩株均為Van基因陰性,見圖1。3不同藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。對(duì)于加入胺基糖蚤的不同本次研究的100株腸球菌中以糞腸球菌和屎腸球菌分離率最高,占總分離率的97%,其中糞腸球菌占86%,屎腸球菌占11%,該構(gòu)成比與國外報(bào)道相似。因此,糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)臨床常用抗生素的耐藥狀況基本上可以反映腸球菌的整體耐藥狀況。從表2可以看出,屎腸球菌對(duì)除萬古霉素和替考拉寧以外其他抗生素的耐藥率明顯高于糞腸球菌。認(rèn)為糞腸球菌對(duì)作用于核酸合成的藥物如喹諾酮類的環(huán)丙沙星較敏感,對(duì)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的氨芐西林較敏感。而替考拉寧作為糖肽類的抑制細(xì)胞壁合成的藥物對(duì)兩者均顯示良好的抑菌作用,未發(fā)現(xiàn)有耐藥株。K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)結(jié)果顯示所有菌株對(duì)萬古霉素的替代品替考拉寧均敏感,而對(duì)萬古霉素耐藥率為1%,說明,替考拉寧的體外抑菌活性大于萬古霉素的體外抑菌活性。用ADSP法檢測(cè)到三株耐萬古霉素的腸球菌(VRE),分離率為3%,與國內(nèi)臨床對(duì)VRE的分離率為1%~4%相符合。K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法受諸多因素影響,如:藥敏紙片的質(zhì)量,接種菌量的準(zhǔn)確與否,抑菌圈測(cè)量工具的影響等。而ADSP法用于篩選VRE較K-B法的敏感性高,漏檢率低。而且,該法操作簡(jiǎn)便易行,結(jié)果易于觀察,適合于臨床篩查VRE。某些腸球菌對(duì)氨基糖甙類具有低水平天然耐藥性,用10μg/片的慶大霉素紙片可全部測(cè)出;還有一些腸球菌對(duì)氨基糖甙類可產(chǎn)生高水平獲得性耐藥,需要用120μg/片的慶大霉素紙片測(cè)出。本研究有54%(54/100)的菌株對(duì)慶大霉素呈高水平耐藥。從表3可以看出,HLGR對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、環(huán)丙沙星的耐藥率明顯高于低耐株。建議在腸球菌的常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)中加做120μg/片的慶大霉素紙片,以加強(qiáng)對(duì)HLGR的監(jiān)測(cè)。ADSP法篩選出的三株VRE糞腸球菌NO.C8、屎腸球菌NO.1511和鉛黃腸球菌NO.2078分別分離于膽汁標(biāo)本、尿液標(biāo)本和血液標(biāo)本中,其中NO.C8來自肝移植病人,NO.1511來自泌尿道結(jié)石病人,NO.2078來自門診病人。三株VRE對(duì)萬古霉素顯示不同程度耐藥的同時(shí),對(duì)除替考拉寧外的其余五種抗生素均耐藥。VRE的多重耐藥性的檢測(cè)為臨床鑒定和分離VRE有一定的意義。試驗(yàn)中采用多重PCR檢測(cè)VRE的基因型,只有其中的鉛黃腸球菌NO.2078是VanC2基因型陽性,其余兩株均為陰性,這可能與本次研究只使用了VanA、VanB、VanC1及VanC2四對(duì)引物有關(guān)系,陰性菌株的基因型有待進(jìn)一步DNA序列分析。有資料顯示,VanA和VanB型VRE為屎腸球菌及糞腸球菌表現(xiàn),其抗藥性表現(xiàn)為:VanA對(duì)萬古霉素和替考拉寧高度耐藥,且可被萬古霉素、替考拉寧所誘導(dǎo);VanB對(duì)萬古霉素顯示不同程度耐藥,但是對(duì)替考拉寧敏感,并且只被萬古霉素誘導(dǎo)。VanC為非誘導(dǎo)型,又分為3個(gè)亞類,即VanC1,VanC2和VanC3,見于鵪鶉腸球菌,鉛黃腸球菌和黃色腸球菌,未見于屎腸球菌。VanC型VRE能引起人體的感染,其耐藥屬于內(nèi)源性,對(duì)萬古霉素和替考拉寧呈固有的低度耐藥。分析鉛黃腸球菌NO.2078的K-B法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,其對(duì)萬古霉素的抑菌環(huán)直徑為15mm,根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)屬于中介范圍,其表型與基因型一致。本次研究未檢測(cè)出具有重要臨床意義。萬古霉素、替考拉寧、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦和環(huán)丙沙星可作為治療糞腸球菌感染的藥物。建議臨床對(duì)氨基糖苷類藥物的合理應(yīng)用,因?yàn)槟c球菌在經(jīng)不合理治療時(shí)可能出現(xiàn)獲得性耐藥。萬古霉素或替考拉寧是目前治療慶大霉素高耐株的理想