冬季溫度變化對虎紋蛙免疫功能和抗氧化能力的影響

冬季溫度變化對虎紋蛙免疫功能和抗氧化能力的影響

今天，世界氣候變化是人類倡導(dǎo)的兩個棲動物群體崩潰和滅絕的重要因素之一。兩棲類作為典型的、由水生向陸生過渡的變溫動物類群,環(huán)境中穩(wěn)定和有規(guī)律的氣溫和降水條件對其生存起著至關(guān)重要的作用。由于氣候異常使得極端天氣的出現(xiàn)變得日趨頻繁,非季節(jié)性的、短期且劇烈的氣溫變化可能會嚴(yán)重影響兩棲類動物機體的生理機能,并能從多種途徑增加其感染疾病的風(fēng)險,最終影響種群的生存與穩(wěn)定。由于生境破壞和人類的濫捕等因素,中國虎紋蛙(Hoplobatrachusrugulosus)野生種群瀕臨滅絕,已被列入中國瀕危動物紅皮書,是我國二級保護動物?；⒓y蛙分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),該物種通常選擇溫暖潮濕的生境,對溫度變化較為敏感。近年來我國南方已經(jīng)開展虎紋蛙的人工馴養(yǎng),但在養(yǎng)殖實踐中發(fā)現(xiàn)該蛙耐寒性較差,尤其在氣溫波動幅度較大的季節(jié)交替期,患病率和死亡率均較高,嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,急需相關(guān)的技術(shù)資料。為此,本研究監(jiān)測了浙江省金華市南山野生虎紋蛙分布區(qū)冬季的環(huán)境氣溫,在實驗室條件下研究了虎紋蛙在短期梯度降溫和急性冷暴露(即冷休克)下的生存力及冷休克對機體免疫功能和抗氧化能力的影響。研究結(jié)果可為探討全球氣候變化導(dǎo)致兩棲類種群衰退的機制提供理論依據(jù),并為該蛙的人工養(yǎng)殖提供技術(shù)支持。1材料和方法1.1環(huán)境監(jiān)測時間間隔設(shè)置利用溫度記錄儀(RC-20,上海精創(chuàng)公司)于2009年12月1日至2010年3月31日對浙江金華南山虎紋蛙分布區(qū)進行環(huán)境溫度監(jiān)測。通過程序設(shè)置,將溫度記錄儀監(jiān)測的時間間隔設(shè)為1次/h。溫度探頭置于較淺的洞穴內(nèi)(距洞口約10cm處),以免陽光直射和雨水浸泡。1.2水環(huán)境及繁殖時間由于虎紋蛙屬于國家二級保護動物,本研究所用虎紋蛙均選自浙江省金華市某虎紋蛙養(yǎng)殖場。將蛙飼養(yǎng)于水族箱(90cm×40cm×40cm,20只/缸)內(nèi),提供較充足的水陸環(huán)境和遮蔽物,控制水溫(22±1)℃,光周期為12L∶12D,每日以黃粉蟲(Tenebriomolitor)活體作為餌料投食1次,隔日用經(jīng)曝氣脫氯的自來水換水1/3,馴化時間為1周。1.3低溫升溫mir-133,sc選擇100只體重相近、體表無傷的健康虎紋蛙(75.77±1.66)g隨機分配至4個玻璃槽內(nèi)(30cm×20cm×15cm,保持1cm水位),然后置入可精確控溫的低溫恒溫培養(yǎng)箱(MIR-253,SANYO,Japan)內(nèi)。培養(yǎng)箱起始溫度設(shè)定為(22±0.5)℃,通過編程設(shè)置降溫速率為2℃/24h,每24h記錄死亡個體數(shù),計算累積死亡率。1.4虎紋蛙中總死亡率的測定,根據(jù)一般情況,一般分為7個月、10.將60只虎紋蛙隨機分配至3個玻璃槽內(nèi),置入低溫恒溫培養(yǎng)箱,箱內(nèi)溫度預(yù)降至(2±0.5)℃,其它條件同上。在第2、4、6、12、24小時記錄存活情況,計算累積死亡率。另取30只虎紋蛙隨機分為兩組,分別置于兩臺低溫恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。其中,對照組設(shè)為22℃,處理組設(shè)為2℃。冷休克6h(接近半數(shù)致死時間)后,每組取6只蛙用于免疫和抗氧化指標(biāo)分析。1.5免疫指數(shù)的測定1.5.1全血一、全血一血一血蛙經(jīng)毀髓后,斷頭取血,用EDTA-2Na抗凝,采用熒光標(biāo)記法測定蛙全血吞噬能力,吞噬原為經(jīng)熒光標(biāo)記酵母(Saccaromycescerevisiae),參考Miliukiené等方法。1.5.2脾切除術(shù)呼吸爆發(fā)采用氮藍四唑(Bitrobluetetrazolium,NBT)還原法測定蛙脾臟巨噬細胞的呼吸爆發(fā),參照Couso等建立的方法。1.5.3酶活性采用比濁法測定蛙胃溶菌酶活力,以溶壁微球菌(Micrcoccuslysoleikticus)為底物,參考Shugar的方法進行。1.6抗氧化酶活力測定蛙肝臟和腎臟用于測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、抗氧化物谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量以及超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活力,測定方法詳見試劑盒說明書(南京建成生物技術(shù)研究所)。1.7循環(huán)檢驗ndependenst-t-t實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。免疫和抗氧化指標(biāo)相關(guān)數(shù)據(jù)進行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗,符合正態(tài)進行獨立樣本t檢驗(Independent-sampleT-test);死亡率與環(huán)境溫度、冷休克時間相關(guān)分析采用Pearson分析,回歸分析采用CurveEstimation分析。實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示,當(dāng)P<0.05時表示組間差異顯著,當(dāng)P<0.01時表示差異極顯著。2結(jié)果與分析2.1冬季主要保溫區(qū)間監(jiān)測數(shù)據(jù)分析顯示,浙江省金華市南山虎紋蛙自然分布區(qū)內(nèi)冬季溫度范圍普遍在0—14℃之間波動,偶爾會降至0℃以下,其越冬期間的主要低溫區(qū)間在0—4℃,主要高溫區(qū)間在10—14℃(圖1)。2.2累積死亡率當(dāng)溫度降至14℃時未發(fā)現(xiàn)有虎紋蛙死亡,降至12℃以下時虎紋蛙死亡率急劇上升。12℃累積死亡率約為28.1%,10℃為87.5%,8℃為100%。在一定溫度范圍內(nèi),虎紋蛙死亡率與環(huán)境溫度呈顯著負相關(guān)(Pearsontest,r=-0.952,P<0.05),經(jīng)曲線擬合,通過回歸方程計算可得半數(shù)致死溫度為11.5℃(圖2)。2.3虎紋蛙亡率在2℃冷休克4h內(nèi)無死亡現(xiàn)象,但4h以后死亡率急劇增加,6h時死亡率為45%,12h為80%,至24h時虎紋蛙全部死亡。虎紋蛙死亡率與冷休克時間呈顯著正相關(guān)(Pearsontest,r=0.91,P<0.05),經(jīng)曲線擬合,通過回歸方程計算可得半數(shù)致死時間為7.6h(圖3)。2.4冷休克對機體免疫抑制的影響如表1所示,處理組(2℃,6h)脾巨噬細胞呼吸爆發(fā)(NBT反應(yīng))強度(t=3.827,df=6,P<0.05)、胃溶菌酶活力(t=6.37,df=6,P<0.05)、血細胞吞噬能力(t=5.388,df=3.037,P<0.05)均顯著低于對照組(表1),說明冷休克導(dǎo)致機體的免疫抑制。平均值以Mean±SE表示,**表示顯著水平為0.01,n=4—62.5抗氧化酶活性的變化冷休克6h后虎紋蛙肝臟(t=0.773,df=8,P>0.05)和腎臟(t=0.164,df=4.542,P>0.05)組織脂質(zhì)過氧化物MDA含量與對照組無明顯差異(圖4);而肝臟中抗氧化酶SOD的活性顯著升高(t=-3.3,df=6,P<0.05),但腎臟中SOD活力無明顯變化(t=1.708,df=8,P>0.05)(圖5);肝臟(t=-2.817,df=6,P<0.05)和腎臟(t=-11.302,df=6,P<0.05)抗氧化物質(zhì)GSH含量均顯著增加(圖6)。結(jié)果表明冷休克(2℃,6h)能夠誘導(dǎo)機體對抗氧化物質(zhì)需求的增加。3溫度脅迫對虎紋蛙抗氧化能力的影響全球氣候變化導(dǎo)致極端天氣的出現(xiàn)變得日趨頻繁,非季節(jié)性的、短期且劇烈的氣溫變化如入冬前環(huán)境溫度大幅波動可能會嚴(yán)重干擾兩棲類動物種群的生存與穩(wěn)定。然而,國外相關(guān)研究主要集中于野外種群調(diào)查和病原生物調(diào)查,并結(jié)合氣候數(shù)據(jù)進行模型預(yù)測和分析,從而得出氣候異常與兩棲類生存現(xiàn)狀的相關(guān)規(guī)律和假說,而缺乏在實驗室條件下模擬氣候變化導(dǎo)致的氣溫極端變化對兩棲類生理影響的相關(guān)證據(jù)。本研究為了解野生虎紋蛙在自然條件下可能遭遇的冷害程度,通過對浙江金華地區(qū)虎紋蛙分布區(qū)環(huán)境溫度的監(jiān)測(圖1),可以看出在監(jiān)測期內(nèi)冬季高溫區(qū)間在10—14℃,低溫區(qū)間主要在0—4℃。根據(jù)有關(guān)文獻的初步報道,虎紋蛙成蛙的適宜生長溫度范圍為22—28℃,溫度低于12℃時停止攝食開始冬眠,溫度低于4℃易引起死亡。本研究通過梯度降溫實驗發(fā)現(xiàn),在一定溫度范圍內(nèi),虎紋蛙死亡率與環(huán)境溫度呈顯著負相關(guān),表明環(huán)境溫度變化會嚴(yán)重影響虎紋蛙存活率。通過回歸方程計算,11.5℃是虎紋蛙半數(shù)致死溫度,可推測該溫度可能是虎紋蛙在非冬眠狀態(tài)下的低溫耐受臨界點。本研究在野生虎紋蛙可能遭遇的低溫區(qū)間內(nèi)選擇了2℃進行冷休克實驗,發(fā)現(xiàn)死亡率隨冷休克時間延長而增加,在第7.6h虎紋蛙出現(xiàn)半數(shù)致死。這些結(jié)果說明虎紋蛙對環(huán)境溫度較為敏感,反映出熱帶和亞熱帶物種抗寒性較差的特征,但缺乏其它兩棲類相關(guān)研究結(jié)果與之比較。入冬前環(huán)境溫度大幅下降可能會嚴(yán)重降低虎紋蛙的存活率。低等脊椎動的非特異性免疫在免疫防御方面的作用比特異性免疫更為廣泛和重要,尤其在低溫環(huán)境下非特異性免疫占有主導(dǎo)地位,然而非特異性免疫同樣具有明顯的溫度依賴性,如虹鱒(OncorhynchusmykissL.)白細胞數(shù)目和頭腎吞噬細胞呼吸爆發(fā)強度有顯著的季節(jié)性變化,在冬季均降至最低。Nikoskelainen等也發(fā)現(xiàn)低溫能夠降低虹鱒全血呼吸爆發(fā)強度。羅非魚(Oreochromisaureus)在遭受冷刺激(12℃)后,其白細胞吞噬能力顯著下降。中國林蛙(Ranatemporaria)全血吞噬能力會隨環(huán)境溫度降低而降低。豹蛙(Ranapipiens)在低溫暴露(5℃)后其淋巴細胞和白細胞數(shù)目顯著減少。本研究發(fā)現(xiàn)虎紋蛙在冷休克后呼吸爆發(fā)強度和全血吞噬能力也均下降。溶菌酶作為一種廣譜抗菌作用的酶類,其活力具有明顯的溫度依賴特征,如凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、虹鱒、大西洋大比目魚(HippoglossushippoglossusL.)溶菌酶活力在低溫下均受到抑制,本研究結(jié)果與這些研究報道一致。此外,低溫脅迫能夠誘導(dǎo)動物體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),動物體通過丘腦-垂體-腎間組織軸(Hypothalamus-pituitary-interrenalaxis,HPI)分泌一系列應(yīng)激激素包括兒茶酚胺、皮質(zhì)類固醇等,進而抑制機體免疫和代謝等生理功能。因此,可以推測非季節(jié)性低溫脅迫可能能夠破壞虎紋蛙機體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)并誘導(dǎo)免疫抑制,導(dǎo)致機體對病原生物敏感性的增加,加大種群的生存壓力。低溫脅迫能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生過多的活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS),改變細胞的氧化還原狀態(tài),從而打破機體抗氧化系統(tǒng)的平衡。有研究表明,應(yīng)激激素能夠增加肝臟細胞色素P450依賴復(fù)合功能氧化酶系統(tǒng)的活力,而該系統(tǒng)是ROS產(chǎn)生的主要來源。在哺乳類研究中發(fā)現(xiàn),大鼠遭受低溫刺激后組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的顯著升高,小白鼠在低水溫環(huán)境游泳會導(dǎo)致肝臟MDA含量顯著增加。在低等脊椎動物中,北海綿鳚(Zoarcesviviparus)在5℃下冷刺激2h后其MDA含量也有所增加。然而,樹蛙(Ranasylvatica)經(jīng)過冷凍后組織MDA含量卻無明顯變化,本研究的結(jié)果與此類似,說明不同低溫脅迫方式可能會導(dǎo)致不同的結(jié)果,或不同物種間存在反應(yīng)差異。另外,低溫脅迫能夠誘導(dǎo)皮質(zhì)類固醇的升高,該類激素會刺激抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生。如大鼠受到冷刺激后腎臟和肝臟SOD活性明顯增強。Katja等對北海綿鳚進行1℃急性冷刺激也發(fā)現(xiàn)其肝臟抗氧化酶SOD活性顯著增加。在本研究中,虎紋蛙肝臟SOD活力在冷休克后顯著增加,而腎臟卻無顯著變化。這可能是由于肝臟含有大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體上的NADPH-細胞色素P450酶系統(tǒng)是細胞脂質(zhì)過氧化物質(zhì)產(chǎn)生的主要來源,因此肝臟需要產(chǎn)生足夠SOD用于抗氧化。GSH是清除氧自由基重要的非酶抗氧化物質(zhì),本研究表明冷休克增加了虎紋蛙肝臟和腎臟GSH含量,這與北海綿鳚的研究相一致。但是,哺乳類如多紋黃鼠(Spermophilustridecemlineatus)在冬眠期間腸粘膜GSH含量降低,且GSH還原酶活性降低了50%;又如大鼠在遭受