第六章 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定課件

第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專(zhuān)一N-端fMet或Met的切除二硫鍵的形成化學(xué)修飾剪切第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定泛素化對(duì)于細(xì)胞分化與凋亡、DNA修復(fù)、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)等生理過(guò)程起著重要作用磷酸化涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等生理病理過(guò)程糖基化在許多生物過(guò)程中如免疫保護(hù)、病毒的復(fù)制、細(xì)胞生長(zhǎng)、炎癥的產(chǎn)生等起著重要的作用脂基化對(duì)于生物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程起著非常關(guān)鍵的作用組蛋白上的甲基化和乙酰化與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第一節(jié)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定一、生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)磷酸化修飾及其功能蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)是指通過(guò)酶促反應(yīng)把磷酸基團(tuán)從一個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物上的過(guò)程,是生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)的傳遞過(guò)程中占有極其重要的地位蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過(guò)程第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用在胞內(nèi)介導(dǎo)胞外信號(hào)時(shí)具有專(zhuān)一應(yīng)答特點(diǎn)胞內(nèi)信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化控制了細(xì)胞內(nèi)已有的酶“活性”對(duì)外界信號(hào)具有級(jí)聯(lián)放大作用蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化保證了細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的持續(xù)反應(yīng)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定

磷酸化類(lèi)型絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸酯化精氨酸、組氨酸和賴(lài)氨酸的亞酰胺化，天冬氨酸和谷氨酸的酰化絲氨酸磷酸化：蘇氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化=1800：200：1第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定被磷酸化修飾的蛋白改變所帶的電荷改變催化基團(tuán)的性質(zhì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞分步蛋白質(zhì)功能變化的多樣性第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定蛋白質(zhì)磷酸化研究有三個(gè)主要目的(1)對(duì)位于某一特定狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的給定蛋白質(zhì)在體內(nèi)的磷酸化氨基酸殘基定位(2)鑒定與磷酸化過(guò)程有關(guān)的激酶(3)分析所觀察到的磷酸化現(xiàn)象對(duì)功能的影響第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述磷酸化修飾蛋白質(zhì)的識(shí)別與檢測(cè)是影響磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一細(xì)胞內(nèi)僅有少部分蛋白質(zhì)被磷酸化,即使蛋白質(zhì)的表達(dá)量處于相對(duì)較高的水平,該蛋白質(zhì)的磷酸化部分的分析也很困難,一般一個(gè)發(fā)生磷酸化的蛋白質(zhì)其磷酸化的部分僅占其總量的10%

磷酸化蛋白質(zhì)含量少，化學(xué)計(jì)量值低，磷酸化的肽段很容易淹沒(méi)在大量非磷酸化的肽段中第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述體外pmol體內(nèi)fmol32p蛋白標(biāo)記32p細(xì)胞標(biāo)記蛋白質(zhì)分離蛋白酶切蛋白酶切2DPP作圖2DPP作圖μLC－ESI-MS或MALDI-MSμLC－ESI-MSμHPLCIMAC磷酸氨基酸分析相關(guān)分析第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述雙相磷酸多肽譜圖

2D—PP多肽在薄層纖維板上進(jìn)行電泳是第一相，在同一塊板上進(jìn)行薄層色譜(TCL)為第二相，分離得到的磷酸肽用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測(cè)此方法提供了其他方法不能提供的有關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的重要信息

(1)磷酸化位點(diǎn)的最大數(shù)目(2)放射自顯影強(qiáng)度提供了在所有磷酸化肽中磷酸化的相對(duì)化學(xué)計(jì)量(3)電泳和TCL的正交分離提供了磷酸肽之間親水性的相對(duì)狀態(tài)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述磷酸肽本身所具有的負(fù)電性使其在正離子模式的質(zhì)譜分析中信號(hào)受到抑制，在MALDI源的質(zhì)譜儀中磷酸肽的信號(hào)豐度會(huì)比其相應(yīng)未磷酸化肽段的信號(hào)強(qiáng)度要低很多磷酰鍵較肽鍵容易斷裂，使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白鑒定要困難的多第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定三、磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)32P放射性標(biāo)記法抗體免疫印跡檢測(cè)法第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、32P放射性標(biāo)記法32

P放射性標(biāo)記法是最經(jīng)典的磷酸化蛋白質(zhì)檢測(cè)方法放射性32P標(biāo)記的ATP處理細(xì)胞，使32P摻入磷酸化蛋白質(zhì)培養(yǎng)待標(biāo)記的細(xì)胞至適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)期，在生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞中磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到最高峰，用不含磷酸鹽的標(biāo)記培養(yǎng)液替換原來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入32P標(biāo)記磷酸鹽共培養(yǎng)，使細(xì)胞ATP庫(kù)與32P平衡，蛋白激酶利用被放射標(biāo)記的ATP使底物磷酸化第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定局限性磷酸轉(zhuǎn)換速率較低的磷酸化蛋白質(zhì)不能標(biāo)記組織樣本放射性污染第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定2、抗體免疫印跡檢測(cè)法通過(guò)抗磷酸氨基酸抗體與磷酸化蛋白質(zhì)的免疫印跡反應(yīng)(Westernblotting)來(lái)檢出磷酸化蛋白質(zhì)是較常用的方法在真核細(xì)胞中最常見(jiàn)的磷酸化修飾是在蛋白質(zhì)的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈羥基磷酸化已經(jīng)有商品化的抗酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸磷酸鹽抗體,其中抗酪氨酸磷酸鹽抗體的特異性最好，磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的抗原決定簇較小,抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)有空間障礙,所以抗體的結(jié)合力較差免疫印跡法與免疫沉淀相結(jié)合,可以在電泳之前先富集目的蛋白質(zhì),但這樣也有可能丟失部分低豐度的目的蛋白質(zhì),同時(shí)免疫沉淀技術(shù)對(duì)抗體的要求更高,抗磷酸酪氨酸抗體具有較好的親和性可以進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定樣品制備（細(xì)胞、組織、體液提取蛋白質(zhì)）制備型2D膠電泳分析型2D膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色轉(zhuǎn)印到膜找出相應(yīng)的磷酸化蛋白質(zhì)磷酸氨基酸抗體免疫檢測(cè)—得到磷酸化蛋白質(zhì)染色—得到全部蛋白質(zhì)點(diǎn)磷酸化蛋白質(zhì)鑒定圖譜比較第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定四、蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的分析1、磷酸肽的分離和富集分離濃縮分析物，提高信噪比如果磷酸肽被放射性標(biāo)記，并具有相同的比活度，那么每一個(gè)被分離的肽段相應(yīng)的活度計(jì)數(shù)就表明這一組分中磷酸肽的相對(duì)量，如果已知所用放射性標(biāo)記物的比活，就能容易算出磷酸肽的絕對(duì)量放射性標(biāo)記的磷酸肽的分離譜可以用來(lái)定量檢測(cè)不同時(shí)間或細(xì)胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)磷酸肽狀態(tài)的變化肽分離方法也有效地除去了非肽類(lèi)雜質(zhì)，更有利檢測(cè)和分析低豐度磷酸肽第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、磷酸肽的分離和富集方法反相液相色譜（PR-HPLC）免疫沉淀固相金屬親和色譜金屬氧化物/氫氧化物親和色譜離子交換和等電聚焦第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定免疫沉淀第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定原理當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)免疫沉淀物第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定固相金屬親和色譜Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMACIMAC柱：金屬離子、螯合劑、填料原理：帶正電的金屬離子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+可以與帶負(fù)電的磷酸集團(tuán)產(chǎn)生靜電交互作用而結(jié)合，這種結(jié)合能力受pH值、離子強(qiáng)度和溶液有機(jī)相的影響，在高pH或磷酸鹽存在的緩沖液中，金屬離子與磷酸基團(tuán)間的結(jié)合被破環(huán)，磷酸肽被釋放出來(lái)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定局限性丟失低豐度、沒(méi)有結(jié)合到IMAC柱上的磷酸化肽段具有多磷酸化位點(diǎn)的肽由于較強(qiáng)的親和力較難被洗脫下來(lái)酸性基團(tuán)（天冬氨酸、谷氨酸）、電子供體（組氨酸）也會(huì)結(jié)合到柱上，造成非磷酸化肽的污染效果：依賴(lài)于所選擇的金屬離子、填充柱的材料及洗脫程序第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定金屬氧化物/氫氧化物親和色譜Metaloxide/hydroxideaffinitychromatography,MOACTiO2、Al(OH)3、ZrO2TiO2富集磷酸肽原理：

TiO2是一種兩性物質(zhì)，由于鈦原子和氧原子的原子表面化合價(jià)不飽和，TiO2在不同的pH值下可以表現(xiàn)為路易斯酸或路易斯堿在酸性溶液中，鈦原子帶正電表現(xiàn)為路易斯酸，可以與陰離子結(jié)合。磷酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽都與TiO2具有高度的親和力，其中TiO2與磷酸鹽的結(jié)合能力最高調(diào)節(jié)pH值后，TiO2可用于富集磷酸肽第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定離子交換和等電聚焦離子交換（strongaionexchange,SAX/strongcaionexchange,SCX）:離子強(qiáng)度不同進(jìn)行分離IEF:等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離主要用于復(fù)雜樣本的預(yù)分離，降低樣本復(fù)雜程度結(jié)合金屬親和等其他富集技術(shù)，可取得很好的效果第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定2、磷酸肽的識(shí)別質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合磷酸酶水解第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定MALDI-TOFMS

可以通過(guò)肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質(zhì)，與磷酸酯酶處理相結(jié)合可以確定磷酸化位點(diǎn)原理：磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽丟失磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生特定質(zhì)量數(shù)的變化，MALDI-TOFMS通過(guò)檢測(cè)這種質(zhì)量數(shù)的變化而確定磷酸化位點(diǎn)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定原理通過(guò)MALDI-TOF/TOF一級(jí)質(zhì)譜可發(fā)現(xiàn)與肽段分子量理論值相差80Da

(HPO3=80Da)的質(zhì)譜峰,該峰的二級(jí)質(zhì)譜圖中如果母離子與旁邊的最高強(qiáng)度的質(zhì)譜峰相差98Da(中性丟失H3PO4=98Da),則可確定該肽段為磷酸化肽段,

進(jìn)一步通過(guò)二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜的譜圖確認(rèn)具體的磷酸化位點(diǎn)

利用β－消除反應(yīng)使絲氨酸、蘇氨酸磷酸化殘基轉(zhuǎn)化為氨乙基丙氨酸,后者為賴(lài)氨酸的同形物,此位點(diǎn)可被胰蛋白酶和Lys-C

肽鏈內(nèi)切酶等酶特異性識(shí)別、酶切,通過(guò)質(zhì)譜即可很容易地判斷磷酸化位點(diǎn)。消除反應(yīng)是從反應(yīng)物的相鄰碳原子上消除兩個(gè)原子或基團(tuán)，形成一個(gè)π鍵的過(guò)程

1,2–

消除反應(yīng)（β-消除反應(yīng)）第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定PSD-MALDI-MS分析源后衰變發(fā)生在源內(nèi)離子化之后的分子裂解MALDI-TOF-MS離子源內(nèi)發(fā)生的離子在真空無(wú)電場(chǎng)飛行管飛行過(guò)程中發(fā)生結(jié)構(gòu)裂解，丟失一個(gè)中性分子后產(chǎn)生了碎片離子碎片離子具有與其前體離子相同的飛行速度，但由于質(zhì)量小，動(dòng)能比前體離子小（亞穩(wěn)離子）β－消除反應(yīng)丟失HPO3或H3PO4，產(chǎn)生數(shù)減少80Da或98Da亞穩(wěn)離子第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定圖利用MALDI-TOF/TOF譜圖鑒定磷酸化肽段a:酶切產(chǎn)物的一級(jí)質(zhì)譜圖。磷酸化肽段的質(zhì)譜峰用星號(hào)標(biāo)出,其相對(duì)未磷酸化肽段的理論分子量位移80Da(HPO3=80Da);b:a中標(biāo)記星號(hào)的質(zhì)譜峰的二級(jí)質(zhì)譜分析。在圖中可見(jiàn)比母離子小98Da(H3PO4=98Da)的中性缺失峰

第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)前體離子掃描通過(guò)檢測(cè)磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的特定片段來(lái)報(bào)告磷酸肽的存在；磷酸化肽經(jīng)CID（碰撞誘導(dǎo)解離）后會(huì)產(chǎn)生磷酸基團(tuán)的特異性片段，這些特異性的片段在用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行前體離子掃描時(shí)可作為磷酸肽的“報(bào)告離子”第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定前體離子掃描在三級(jí)四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜采用使各種質(zhì)荷比的離子依次通過(guò)Q1分析器，Q2為碰撞誘導(dǎo)解離室，將Q3分析器的電壓和頻率設(shè)定為只能傳輸某一特定質(zhì)荷比，即特定質(zhì)荷比的子離子直接檢測(cè)在碰撞誘導(dǎo)解離過(guò)程中丟失的碎片離子第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定前體離子掃描分析磷酸肽負(fù)離子模式設(shè)定Q3中僅能通過(guò)的子離子質(zhì)荷比m/z79，即磷酸肽丟失的PO3-，這樣得到的質(zhì)譜圖僅顯示丟失m/z79的離子的譜峰丟失磷酸根離子的磷酸肽譜峰多肽產(chǎn)生的各種碎片離子中，質(zhì)量數(shù)在79Da附近的幾乎沒(méi)有第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定中性丟失掃描具有兩級(jí)質(zhì)量分析器和碰撞誘導(dǎo)解離室的串聯(lián)質(zhì)譜儀Q1和Q2同步掃描，但掃描范圍不一樣，保持一個(gè)特定的電壓差值，這個(gè)電壓差所代表的質(zhì)荷比m/z值代表一個(gè)中性分子的質(zhì)量將Q1輸送來(lái)的離子碰撞誘導(dǎo)裂解，再將碎片離子送入Q3只有在Q2中誘導(dǎo)裂解后能丟失這一特定中性分子的離子才會(huì)被Q3傳輸?shù)綑z測(cè)器第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定中性丟失掃描分析磷酸肽從帶一個(gè)正電荷的[M+H]+肽混合物中尋找丟失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，則Q1和Q3的掃描電壓差所代表的質(zhì)荷比應(yīng)為m/z98從帶兩個(gè)正電荷的[M+2H]2+肽混合物中尋找丟失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，則Q1和Q3的掃描電壓差所代表的質(zhì)荷比應(yīng)為m/z49只能分析磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定3、磷酸化氨基酸位點(diǎn)的確定用于確定磷酸化肽中磷酸化位點(diǎn)的質(zhì)譜方法基于兩種不同原理第一種方法取決于磷酸酯鍵的化學(xué)穩(wěn)定性如在ESI質(zhì)譜儀的碰撞室或離子源中，或在MALDI—MS的源后裂解（PSD）過(guò)程中磷酸化肽可通過(guò)磷酸酯鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第二種方法基于肽段增加的磷酸酯基團(tuán)的質(zhì)量數(shù)如果蛋白是已知的，可通過(guò)質(zhì)量數(shù)來(lái)確定肽段在某些情況下，肽段只含有一個(gè)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，則很容易找到磷酸化位點(diǎn)，但在大多數(shù)情況下肽段含有許多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，則確定磷酸化位點(diǎn)發(fā)生困難

第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定五、蛋白質(zhì)磷酸化的定量分析定量：磷酸化蛋白與其對(duì)應(yīng)的非磷酸化蛋白質(zhì)的比例研究的蛋白樣本酶切后等分成兩部分,一部分直接用CH3OH甲酯化,另一部分經(jīng)過(guò)磷酸酯酶處理后用CD3OH甲酯化,隨后將兩者混合進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜研究,即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信息該技術(shù)設(shè)計(jì)巧妙,但甲酯化的效率可能會(huì)影響定量結(jié)果第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的分析技術(shù)SILAC(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture)采用含有輕同位素型和重同位素型氨基酸的培養(yǎng)液對(duì)不同細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng),使細(xì)胞內(nèi)的蛋白被同位素穩(wěn)定標(biāo)記,提取細(xì)胞蛋白并將其等量混合,酶切后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,通過(guò)分析不同標(biāo)記型肽段的相對(duì)量而確定蛋白的相對(duì)量15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記法、磷酸肽同位素親和標(biāo)記法既可以研究全蛋白質(zhì)組的變化,也可以結(jié)合磷酸化肽段的富集技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行定量研究第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記法一種正常培養(yǎng)基，一種由15N提供N源質(zhì)譜圖中，每一個(gè)水解肽段表現(xiàn)為一對(duì)峰15N/14N的同位素豐度比可以體現(xiàn)出兩種細(xì)胞來(lái)源蛋白質(zhì)表達(dá)量的相對(duì)水平兩種細(xì)胞表達(dá)完全一致，所有15N/14N豐度比將在一個(gè)平均值范圍內(nèi)兩種來(lái)源的蛋白質(zhì)的磷酸化程度不同，其含磷肽段與相應(yīng)未磷酸化肽段的15N/14N的豐度比就與平均值不同，根據(jù)其比值來(lái)進(jìn)行磷酸化程度的相對(duì)定量第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記法第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定磷酸肽同位素親和標(biāo)記法使磷酸肽或磷酸化蛋白在堿性環(huán)境下發(fā)生β消除，同時(shí)用親核試劑攻擊形成的雙鍵并發(fā)生加成反應(yīng)對(duì)不同來(lái)源的磷酸肽或磷酸化蛋白使用不同的親核試劑其中一種試劑上的氫由氘代替再通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在加成的親核試劑上連接一個(gè)親和標(biāo)簽（生物素）第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定磷酸肽同位素親和標(biāo)記法第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定磷酸肽同位素親和標(biāo)記法第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定磷酸肽同位素親和標(biāo)記法第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定磷酸肽同位素親和標(biāo)記法第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第二節(jié)糖基化蛋白質(zhì)的鑒定糖蛋白是由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價(jià)相連構(gòu)成的分子糖蛋白包括酶、激素、載體、凝集素、抗體等糖蛋白攜帶某些蛋白質(zhì)代謝去向的信息寡糖鏈在細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定一、糖蛋白的結(jié)構(gòu)特征糖鏈與蛋白的連接方式①N-糖苷鍵型：寡糖鏈（N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAC的β-羥基）與Asn的酰胺基、N-未端的α-氨基、Lys或Arg的ω-氨基相連②O-糖苷鍵型：寡糖鏈（GalNAC的α-羥基）與Ser、Thr和羥基賴(lài)氨酸、羥脯氨酸的羥基相連③S-糖苷鍵型：以半胱氨酸為連接點(diǎn)的糖肽鍵④酯糖苷鍵型：以天冬氨酸、谷氨酸的游離羧基為連接點(diǎn)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定糖蛋白中糖鏈的結(jié)構(gòu)

糖蛋白中的糖鏈變化較大，含有豐富的結(jié)構(gòu)信息，寡糖鏈往往是受體、酶類(lèi)的識(shí)別位點(diǎn)N-糖苷鍵型（N-連接）①高甘露糖型：由GlcNAc和甘露糖組成②復(fù)合型：除了GlcNAc和甘露糖外、還有果糖、半乳糖、唾液酸；③雜合型：包含①和②的特征，五糖核心O-糖苷鍵型（O-連接）沒(méi)有五糖核心第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定分類(lèi)可溶性糖蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)液、各種體液及腔道腺體分泌的粘液中血漿蛋白除白蛋白外皆為糖蛋白。包括酶（如核酸酶類(lèi)、蛋白酶類(lèi)、糖苷酶類(lèi)）、肽類(lèi)激素（如絨毛膜促性腺激素、促黃體激素、促甲狀腺素、促紅細(xì)胞生成素）、抗體、補(bǔ)體、以及某些生長(zhǎng)因子、干擾素、抑素、凝集素及毒素等第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定膜結(jié)合糖蛋白肽鏈由疏水肽段及親水肽段組成，疏水肽段可為一至數(shù)個(gè)，并通過(guò)疏水相互作用嵌入膜脂雙層中；親水肽段暴露于膜外糖鏈連接在親水肽段并有嚴(yán)格的方向性：在質(zhì)膜表面糖鏈一律朝外，在細(xì)胞內(nèi)膜一般朝腔面包括酶、受體、凝集素及運(yùn)載蛋白等，常參與細(xì)胞識(shí)別，并可作為特定細(xì)胞或細(xì)胞在特定階段的表面標(biāo)志或表面抗原第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定凝集素糖結(jié)合蛋白，能專(zhuān)一識(shí)別某一特定的單糖或寡糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合富集、濃縮、分離、糖鏈的結(jié)構(gòu)分析第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定結(jié)構(gòu)糖蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)中的不溶性大分子糖蛋白膠原及各種非膠原糖蛋白(纖粘連蛋白、層粘連蛋白等)作為細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分起支持、連接及緩沖作用，參與細(xì)胞的識(shí)別、粘著及遷移，并調(diào)控細(xì)胞的增殖及分化

第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定二、生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定糖蛋白糖蛋白糖苷內(nèi)切酶還原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TO-MS糖含量相對(duì)分子量MALDI-TO-MSESI串聯(lián)質(zhì)譜凝集素提取氨基酸序列糖基化位點(diǎn)糖肽片段第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定糖含量、糖苷鍵類(lèi)型、糖基化位點(diǎn)是糖蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)糖蛋白的平均分子量及糖含量的測(cè)定糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切掉，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖比較，就能直接表述糖鏈的平均質(zhì)量，而糖蛋白的平均糖含量可由糖鏈的平均質(zhì)量占糖蛋白平均相對(duì)分子質(zhì)量的百分比來(lái)表示第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定糖基化類(lèi)型及糖基化位點(diǎn)的確定蛋白酶酶切和糖苷內(nèi)切酶相結(jié)合先用蛋白酶將糖蛋白酶切成含有或不含有糖鏈的肽片段，獲得糖蛋白的肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除，其肽質(zhì)量指紋譜將發(fā)生變化，原含有糖肽段的質(zhì)量由于糖鏈的丟失在質(zhì)譜圖發(fā)生位移，通過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以得到位移肽段的氨基酸序列，從而確定糖基化位點(diǎn)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、MALDI-TOF-MS的應(yīng)用基質(zhì)的選擇α-腈基－4－羥基肉桂酸第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、MALDI-TOF-MS的應(yīng)用糖蛋白的平均分子質(zhì)量及糖含量的測(cè)定糖蛋白分子結(jié)構(gòu)具有不均一性糖鏈的微不均一性糖基化位點(diǎn)的不均一性多羥基結(jié)構(gòu)的糖鏈?zhǔn)蛊滟|(zhì)子化能力低糖鏈末端唾液酸的干擾第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、MALDI-TOF-MS的應(yīng)用糖蛋白的平均分子質(zhì)量及糖含量的測(cè)定糖鏈的微不均一性質(zhì)譜圖上表現(xiàn)一簇峰G＋各峰之間約相差一個(gè)糖基有時(shí)還出現(xiàn)雙電荷峰G2＋分子離子峰變寬，糖鏈分子質(zhì)量越大，峰越寬，靈敏度越差第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、MALDI-TOF-MS的應(yīng)用典型的糖蛋白的出峰模式，不均一性造成多種糖形存在為51000的雙電荷峰雜質(zhì)N-糖基化質(zhì)譜分析圖第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、MALDI-TOF-MS的應(yīng)用去糖基化處理的質(zhì)譜分析圖去糖基化的單電荷峰，圖譜變得簡(jiǎn)單且峰形尖銳去糖基化的雙電荷峰完整的未發(fā)生去糖基化的單電荷峰第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、MALDI-TOF-MS的應(yīng)用經(jīng)唾液酸酶去唾液酸化處理的質(zhì)譜分析去唾液酸化的單電荷峰去唾液酸化的雙電荷峰非特異性降解產(chǎn)物第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定1、MALDI-TOF-MS的應(yīng)用糖基化類(lèi)型及糖基化位點(diǎn)的確定尋找質(zhì)譜圖上峰的位移從位移峰的肽段序列中，尋找出可能連接糖鏈的氨基酸第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖鏈結(jié)構(gòu)的分析串聯(lián)質(zhì)譜的母離子掃描技術(shù)選擇特定的糖鏈離子，經(jīng)碰撞活化使用惰性氣體將其打碎，從而推斷糖鏈結(jié)構(gòu)如人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)分析選擇以HPLC分離的一個(gè)糖鏈，其分子離子雙電荷[M+2H]2＋在電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜中為823.8，將其設(shè)為母離子，以惰性氣體與其碰撞產(chǎn)生碎片第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖鏈結(jié)構(gòu)的分析第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖鏈結(jié)構(gòu)的分析中性丟失第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定3、凝集素在糖蛋白分析中的應(yīng)用伴刀豆蛋白（ConA）對(duì)高甘露糖型N-糖鏈有專(zhuān)一性麥胚凝集素（WGA）對(duì)雜合型N-糖鏈有專(zhuān)一性兵豆凝集素對(duì)親和核心巖藻糖類(lèi)糖鏈有專(zhuān)一性第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定糖蛋白結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析母離子第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定糖蛋白結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析由于N-糖蛋白殼二糖核心中與天冬酰胺連接的乙酰葡萄糖胺殘基會(huì)在碰撞過(guò)程中發(fā)生跨環(huán)斷裂，先后產(chǎn)生質(zhì)荷比相差120，80的中性碎片丟失，這兩個(gè)碎片是發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)及糖肽氨基酸序列的標(biāo)志第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定糖蛋白結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定3、凝集素在糖蛋白分析中的應(yīng)用第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第三節(jié)蛋白質(zhì)相互作用的鑒定免疫沉淀酵母雙雜交系統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)串聯(lián)親和純化(tandemaffinitypurification，TAP)蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析（proteinfragmentcomplementationanalysis,PCA）蛋白質(zhì)芯片第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定酵母雙雜交（twohybridsystem）研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)建立利用真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)，分別與目標(biāo)蛋白X及可能與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白Y相連，并共同轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞;如果蛋白X與Y能夠發(fā)生相互作用就能使轉(zhuǎn)錄因子原來(lái)分開(kāi)的兩部分結(jié)合，形成完整的活性形式從而激活下游報(bào)告基因;通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物就可判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用

第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定酵母激活因子GAL4：N端：147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱(chēng)誘餌蛋白（bait）（2）與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱(chēng)靶蛋白（prey）（3）帶由一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株酵母雙雜交系統(tǒng)第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定YeastTwoHybrid原理BDXCOOHADcDNANH2

COOH共轉(zhuǎn)化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNAlibraryNH2Gal4Gal4第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定優(yōu)點(diǎn)作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用可采用不同組織、器官、細(xì)胞類(lèi)型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)，能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白以用作大規(guī)模的蛋白篩選，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)找到某些藥物對(duì)相關(guān)組織主要的作用蛋白，對(duì)于藥物的修飾和改進(jìn)明確方向第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定局限性(1)不能研究具有自激活特性的蛋白質(zhì)；(2)只能檢測(cè)兩個(gè)蛋白間的相互作用；(3)檢測(cè)的相互作用需發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)于不能定位到細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)無(wú)法研究；(4)大部分實(shí)驗(yàn)中有將近50%的假陽(yáng)性率，且推測(cè)的相互作用僅有3%在兩種以上的實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定噬菌體展示技術(shù)噬菌體表面展示技術(shù)是一種對(duì)多肽功能非常有效的篩選技術(shù)，即將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達(dá)，展示在噬菌體顆粒的表面由于外源蛋白或多肽的基因型和表型統(tǒng)一在同一噬菌體顆粒內(nèi)，因此，通過(guò)表型篩選就可以獲得它的編碼基因第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達(dá)型第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定外源基因融合于噬菌體不同區(qū)段外殼蛋白基因的表達(dá)模式第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定SolidphaseselectionwithimmunotubesImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBBBBBBBvv第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定biotinantigenSolutionphaseselectionwi