一種登革熱病毒雙靶基因多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)方法的建立

一種登革熱病毒雙靶基因多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)方法的建立

病毒登格熱是由病毒通過(guò)蚊子傳播引起的急性發(fā)熱性疾病。根據(jù)病毒特征的結(jié)構(gòu)特征，可分為四種類型：t、t、h和t。登革熱病毒主要在亞洲、非洲和南美洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)流行。感染登革熱病毒后主要引起癥狀較輕的登革熱,但少數(shù)病例會(huì)出現(xiàn)登革出血熱,甚至在不及時(shí)治療的情況下出現(xiàn)死亡。由于登革熱是一種蚊傳播疾病,一旦在某一地區(qū)發(fā)生,極容易傳播擴(kuò)散。登革熱在全球100多個(gè)國(guó)家發(fā)生過(guò)流行,25億人具有感染的風(fēng)險(xiǎn),每年大約有5000萬(wàn)人感染登革熱病毒,我國(guó)南方地區(qū)也經(jīng)常有血清檢測(cè)陽(yáng)性以及病毒分離情況的文獻(xiàn)報(bào)道。感染一種登革熱病毒型別后可以對(duì)該型登革病毒產(chǎn)生終生免疫,但不能對(duì)其他型別產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。登革熱的嚴(yán)重癥狀——登革出血熱與登革熱病毒型別有關(guān),再次感染其他型別的登革熱病毒是導(dǎo)致登革出血熱的原因之一。目前還沒(méi)有一種有效的疫苗防治登革熱的發(fā)生,其防治工作非常困難。因此,對(duì)登革病毒進(jìn)行快速檢測(cè)和分型,對(duì)登革熱的臨床診斷和綜合防治具有重要意義。本研究設(shè)計(jì)了一種登革熱病毒多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系,可快速準(zhǔn)確地對(duì)登革熱病毒進(jìn)行檢測(cè)和分型。1材料和方法1.1檢驗(yàn)評(píng)論員3實(shí)驗(yàn)室惠饋登革熱病毒4個(gè)基因型標(biāo)準(zhǔn)株提取物由廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局P3實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。陽(yáng)性樣本為20例登革熱病毒病人急性發(fā)作期提取的核酸標(biāo)本;陰性對(duì)照來(lái)自20例正常無(wú)癥狀人群標(biāo)本。1.2主要設(shè)備實(shí)驗(yàn)所使用儀器設(shè)備為美國(guó)ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀、EPPENDORF冷凍離心機(jī)。1.3熒光rtpcr反應(yīng)試劑柱式病毒RNA提取試劑購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;DRR064A熒光RTPCR反應(yīng)試劑購(gòu)自大連寶生物公司;其他生化試劑和引物探針合成物購(gòu)自上海生工生物工程公司。1.4整體推進(jìn)qaamprna提取柱的制備采用QIAGEN病毒RNA提取試劑盒,將560μ1準(zhǔn)備好的含有CarrierRNA的AVL緩沖液加入1.5ml離心管;取血清140μl,室溫(15~25℃)孵育10min;將1.5ml離心管短暫離心,消除管蓋內(nèi)的液滴;加入560μl乙醇,震蕩混勻15s;將離心管短暫離心,消除管蓋內(nèi)的液滴;將630μl上一步驟中的溶液小心轉(zhuǎn)入QIAampRNA提取柱,注意不要碰濕柱子邊緣。蓋上蓋子,6000×g離心1min。將柱子移入一新的2ml收集管,丟棄剩有濾液的收集管;小心打開(kāi)柱子的蓋子,重復(fù)上一步驟1次;加入500μlAW1液,蓋上蓋子,6000×g離心1min。將柱子放入一新的2ml收集管,丟棄剩有濾液的收集管;小心打開(kāi)柱子的蓋子,加入500μlAW2液,蓋上蓋子,全速20000×g離心3min;將柱子放入一新的1.5ml離心管,丟棄剩有濾液的收集管;小心打開(kāi)柱子的蓋子,加入60μl已平衡至室溫的AVE緩沖液,蓋上蓋子,室溫孵育1min,6000×g離心1min。收集核酸于4~8℃保存?zhèn)溆谩?.5熒光pcrroxrewelledpreact反應(yīng)體系采用DRR064A熒光RTPCR反應(yīng)試劑,總體積25μl。2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μl,TaKaRaExTaq誖HS(5U/μl)0.5μl,PrimeScript誖RTEnzymeMixⅡ0.5μl,RNaseFreedH2O1.5μl,ROXReferenceDyeII(50×)0.5μl,上游引物(40μmol/L)各0.5μl,下游引物(40μmol/L)各0.5μl,探針(10μmol/L)各0.5μl,RNA模板5μl(引物和探針序列見(jiàn)表1,引物濃度為40μmol/L,探針濃度為10μmol/L,登革Ⅰ型和Ⅲ型探針用FAM-TAMARA標(biāo)記,登革Ⅱ型和Ⅳ型探針用JOE-TAMARA標(biāo)記,登革通用型探針用CY5-BHQ2標(biāo)記)。反應(yīng)條件:42℃8min;95℃10s,95℃5s,60℃34s,45個(gè)循環(huán));退火溫度按55~60℃間隔1℃分別試驗(yàn)優(yōu)化,退火溫度為60℃時(shí),反應(yīng)曲線呈典型的S型,熒光信號(hào)最強(qiáng),本實(shí)驗(yàn)選擇60℃作為退火溫度進(jìn)行下面的所有熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系中一個(gè)樣本分別同時(shí)在2個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行,一個(gè)反應(yīng)管中的引物探針為Ⅰ、Ⅱ和通用型,另一管中的引物探針為Ⅲ、Ⅳ和通用型,其他反應(yīng)條件和試劑成分比例不變。1.6多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)分別用登革熱病毒4個(gè)基因型以及DEPC處理水、特異性引物PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)為HIV、HCV、HEV的RNA提取物為對(duì)照模板進(jìn)行多重?zé)晒釶CR檢測(cè),以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的特異性。1.7depcr檢測(cè)對(duì)四型登革病毒陽(yáng)性RNA樣本以10倍梯度用DEPC處理水進(jìn)行稀釋,最大稀釋倍數(shù)108,然后以各稀釋液為模板進(jìn)行PCR檢測(cè),反應(yīng)體系為各型登革病毒對(duì)應(yīng)的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系。1.8熒光pcr反應(yīng)體系檢測(cè)選擇檢測(cè)限性實(shí)驗(yàn)中可檢測(cè)到熒光信號(hào)的梯度稀釋樣本,用對(duì)應(yīng)的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系重復(fù)檢測(cè)4次。統(tǒng)計(jì)各型樣本不同稀釋度的CT平均值和變異系數(shù)。1.9樣品檢測(cè)采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法對(duì)20例陽(yáng)性核酸標(biāo)本和20例正常無(wú)癥狀人群標(biāo)本提取的核酸進(jìn)行檢測(cè)。2結(jié)果2.1測(cè)通道的陽(yáng)性反應(yīng)及陰性對(duì)照登革熱病毒4個(gè)基因型模板在相應(yīng)檢測(cè)通道呈典型的陽(yáng)性反應(yīng)曲線,HIV、HCV和HEV的RNA提取物作為陰性對(duì)照模板均為陰性反應(yīng)(圖1)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限各型登革熱病毒隨著稀釋倍數(shù)的增大,檢測(cè)CT值增大,稀釋至105時(shí)均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,106以上時(shí)未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線,經(jīng)測(cè)試計(jì)算最低檢測(cè)限相當(dāng)于103copies/ml。以登革熱病毒I型RNA梯度稀釋的擴(kuò)增結(jié)果為例,擴(kuò)增曲線如圖2。2.3型登革熱病毒rna的ct值將四型登革熱病毒RNA進(jìn)行10、102、103、104稀釋重復(fù)檢測(cè)4次,Ⅰ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為16.6、19.1、22.6、25.9,變異系數(shù)依次為0.56%、0.67%、0.60%、0.96%;Ⅱ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為16.5、19.3、22.4、25.6,變異系數(shù)依次為0.71%、0.32%、0.55%、0.86%;Ⅲ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為17.2、20.3、22.9、26.1,變異系數(shù)依次為1.63%、1.56%、1.83%、2.91%;Ⅳ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為16.8、20.1、23.2、25.8,變異系數(shù)依次為1.66%、1.92%、2.18%、2.65%;登革通用型RNA的CT均值依次為16.9、20.6、23.1、26.5,變異系數(shù)依次為0.56%、1.28%、2.16%、2.06%;以Ⅰ型為例,倍比稀釋的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。2.4不同類型病毒的分型20個(gè)登革熱陽(yáng)性核酸標(biāo)本在通用型檢測(cè)全部為陽(yáng)性,特異性型別檢測(cè)發(fā)現(xiàn)登革熱病毒Ⅰ型10例、登革熱病毒Ⅱ型3例、登革熱病毒Ⅲ型3例、登革熱病毒Ⅳ型4例。20名正常無(wú)癥狀人群標(biāo)本提取的核酸通用型和特異性型別檢測(cè)全部為陰性。3登革熱實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀臨床診斷過(guò)程中通常以血清學(xué)登革熱特異性抗體的檢測(cè)試驗(yàn)作為病毒感染的重要指標(biāo)?；贓LISA檢測(cè)原理的抗登革熱免疫球蛋白(IgM)的存在預(yù)示著近期發(fā)生的登革熱病毒感染。然而,抗登革熱IgM只有在疾病發(fā)生的5d左右后被檢測(cè)到,延誤早期診斷。此外,抗登革熱IgM抗體可以持續(xù)數(shù)月。除非連續(xù)的樣品進(jìn)行了測(cè)試,進(jìn)行滴度對(duì)比才具有臨床診斷價(jià)值,而且抗登革熱IgM與其他黃病毒的交叉反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)的問(wèn)題。PCR檢測(cè)能夠直接檢測(cè)病原體的靶核酸,是病毒物質(zhì)快速檢測(cè)的重要工具,與其他檢測(cè)方法比較可以提前5~8d檢測(cè)窗口期感染情況。因此,許多學(xué)者在探索基于PCR原理方面的登革熱病毒快速檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù),不僅具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),而且由于該法采用引物和探針的雙重選擇作用,因此特異性更強(qiáng),可避免普通PCR技術(shù)帶來(lái)的假陽(yáng)性反應(yīng)。本研究顯示,實(shí)時(shí)熒光PCR不但可以檢測(cè)單個(gè)靶基因,而且能實(shí)現(xiàn)任意2個(gè)甚至多個(gè)靶基因的同時(shí)檢測(cè),在檢測(cè)領(lǐng)域越來(lái)越受重視。同時(shí)多重?zé)晒釶CR的檢測(cè)靈敏度與單重?zé)晒釶CR的檢測(cè)靈敏度無(wú)明顯差異,本研究中選擇了FAM、JOE、CY5這三種主波長(zhǎng)差異較大的標(biāo)記物,從而有效防止不同靶基因檢測(cè)結(jié)果可能產(chǎn)生的相互干擾。本研究建立的對(duì)同一樣本特異性型別基因和通用型基因雙靶基因多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法能夠?qū)Φ歉餆岵《靖咄靠焖勹b定。雙靶基因檢測(cè)中,通用型引物探針用于篩查檢測(cè),特異性型別引物探針用于檢測(cè)分型,這樣可以提高登革熱的檢測(cè)靈敏度,避免因某個(gè)基因區(qū)域的變異出現(xiàn)漏檢情況。國(guó)內(nèi)外登革熱實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)主要為單一每個(gè)型別分別檢測(cè)或只進(jìn)行通用型檢測(cè)而不