葡萄糖-6-磷酸(Glucose6-phosphate6PG)含量測定試劑盒說明書

第第頁葡萄糖-6-磷酸(Glucose6-phosphate，6PG)含量測定試劑盒說明書葡萄糖6磷酸(Glucose6phosphate，6PG)含量測定試劑盒說明書微量法100管/48樣注意：正式測定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：6PG(Glucose6phosphate，葡萄糖6磷酸，又稱6磷酸葡萄糖)，是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)植物體和微生物中。在糖酵解的第一步反應(yīng)中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖6磷酸，然后通過磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖6磷酸，以繼續(xù)糖酵解的其它步驟；而在戊糖磷酸途徑中，葡萄糖6磷酸是其第一個(gè)底物，該過程也是生成NADPH的主要途徑。此外，葡萄糖6磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被儲(chǔ)存起來。測定原理：6磷酸葡萄糖脫氫酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在1mPMS的作用下使WST8顯橙黃色，在450nm下測定吸光值。需自備的儀器和用品：酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水。試劑的組成和配制：提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；試劑一：液體12mL×1瓶，4℃保存；試劑二：粉劑×1瓶，20℃保存；試劑三：液體1.5mL×1管，4℃避光保存。6PG提?。?、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g，25℃離心10min，取上清待測。2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g，25℃離心10min，取上清待測。3、血清（漿）等液體樣品：直接測定。測定步驟：1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm。2、試劑二的配制：臨用前加入3mL水充分溶解待用，用不完的試劑分裝后20℃保存；3、工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液試劑名稱（μL）測定工作液對照工作液試劑一100100試劑二50水50試劑三10104、樣本測定按下表在96孔板中加入如下試劑試劑名稱（μL）測定管對照管樣本5050測定工作液150對照工作液15037℃避光孵育30min，450nm下測定吸光值A(chǔ)測定與A對照，△A=A測定A對照。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。6PG含量計(jì)算：1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y=3.8589x0.0016，R2=0.997；x為6PG含量（μmol/mL），y為吸光值。2、按照血清（漿）體積計(jì)算6PG含量（nmol/mL）=[(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000=259.1×(△A+0.0016)3、按照蛋白濃度計(jì)算6PG含量（nmol/mgprot）=[(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000=259.1×(△A+0.0016)÷Cpr4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算6PG含量（nmol/g鮮重）=[(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W×V1÷V2）×1000=259.1×(△A+0.0016)÷W3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算6PG含量（nmol/104cell）=[(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷（500×V1÷V2）×1000=0.518×(△A+0.0016)V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V