以株洲市乳腺癌腹水瘤細胞制備大鼠脛骨骨癌痛模型

以株洲市乳腺癌腹水瘤細胞制備大鼠脛骨骨癌痛模型

癌癥痛是一種慢性疼痛。世界上每年有900多萬人患有各種腫瘤，每天有1500萬人遭受腫瘤和癌癥的折磨。癌痛常見于發(fā)生骨轉移的腫瘤患者,尤其以肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等為多見,常常累及胸、腰椎和骨盆等部位。由于機制不明,骨癌痛尚難以完全控制。長期以來,缺少合適的動物模型是骨癌痛研究的最大障礙。Walker256大鼠乳腺癌細胞系由Walker在1928年培育出,因其良好的致瘤性得到廣泛應用。本課題利用該細胞成功構建大鼠脛骨骨癌痛模型,并對其痛覺行為學、骨影像學變化進行了分析。1材料和方法1.1實驗動物及飼養(yǎng)Walker256大鼠乳腺癌細胞系由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院劉全海教授饋贈。成年雌性Sprague-Dawley大鼠,體重250~300g,由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[實驗動物合格證號為SCXK(滬)2002-0006],大鼠飼養(yǎng)在恒溫、通風良好的環(huán)境中,供以充足的食物和水。每次行為實驗前均進行環(huán)境適應性訓練,以排除應激干擾。所有實驗均嚴格按照國際實驗動物使用準則對動物進行處理。隨機分3組:模型大鼠52只,假手術組20只,正常組10只。1.2成分血的檢測取出Walker256細胞凍存管,放入37℃水浴鍋中快速解凍。吸出細胞懸液,加PBS使細胞懸浮。1500×g離心5min,棄上清,重復漂洗1次,加適量PBS,調整密度為1×107個/ml。選60~80g的SD幼年雌性大鼠,抽0.5ml腫瘤細胞接種幼鼠腹腔中。6~7d后待幼鼠出現腹水癥時,抽取含腫瘤細胞的腹水。將收集到的腹水瘤細胞在1200×g下離心3min,棄上清。用PBS沖洗后再以1200×g離心3min。然后用PBS調整細胞密度為5×103個/μl以作接種使用。假接種手術組中,取腹水瘤細胞水浴煮30min將細胞滅活,以同樣密度植入。1.3骨面微核試驗10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后,以大鼠腳趾對有齒鑷鉗夾無反應為麻醉滿意指標。消毒其左側脛骨下1/3皮膚,切開皮膚,分離肌肉,暴露脛骨骨面。用直徑為1mm的不銹鋼手動鉆子(第二軍醫(yī)大學生理學教研室文文博士提供)垂直于骨表面鉆孔后,用25μl微量進樣器深刺入骨髓腔,緩慢注入15μl含有Walker256大鼠乳腺癌細胞的腹水混合液,用無菌骨蠟封孔并逐層消毒縫合。術后將動物放置于37℃熱板上復溫,待其復蘇后送回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。整個手術過程和相關手術器械均嚴格按照無菌手術要求執(zhí)行。假手術動物經微量進樣器注射加熱滅活后的死細胞。1.4ellimpanationda,pid分別在接種瘤細胞后天數(post-cancercellimplantationday,PID)為0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30d稱體重。假手術鼠處理方法同模型組。1.5模型大鼠的行為觀察1.5.1動物痛行為測定選擇PID為0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30d作行走痛行為評分。固定時間將大鼠置于一透明光滑平底塑料盒內(50cm×50cm×40cm),大鼠可在盒內自由走動,待其適應30min后觀察。按如下標準進行痛行為學評分:0分,行動正常,模型側和對照側后肢的動作相同;1分,模型側后肢輕度跛行;2分,模型側后肢跛行的程度在1分和3分之間;3分,模型側后肢有嚴重的跛行;4分,模型側后肢完全不能動作,不能著地。1.5.2y,pwl時間采用336型輻射熱測痛儀測定大鼠對輻射熱刺激反應的閾值。用大鼠的縮爪反應潛伏期(pawwithdrawallatency,PWL)時間表示大鼠熱刺激痛覺閾值。在PID的0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30d,固定時間將大鼠置于半透明的有機玻璃籠中,適應30min后,測定左、右腳掌輻射熱刺激痛覺閾值,2次測試間隔期為10min,以4~5次測定的平均值為檢測值。在測值過程中盡量保持大鼠處在相同狀態(tài)。為避免輻射熱灼傷大鼠皮膚,預先設定熱刺激時間上限為20s。1.5.3網籠制作和分組采用vonFrey系列纖毛測定大鼠對機械刺激反應的閾值。用大鼠的縮爪反應閾值(pawwithdrawalthreshold,PWT)表示大鼠機械刺激痛閾。在PID的0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30d,固定時間將大鼠置于半透明有機玻璃籠中,網籠架置于鐵絲網板上以便實驗操作和觀察。鐵絲網板厚約5mm,小孔直徑1.5mm。適應30min后,將vonFrey絲由下向上垂直刺激大鼠模型側后肢足爪底中外側皮膚表面,以纖毛稍稍彎曲作為完全受力的標準。按照遞增的順序依次施加vonFrey纖毛(1、1.4、2、4、6、8、10、15、26g),每次刺激持續(xù)2s,間隔15s,連續(xù)5次。若3次不抬腿,換用更高克數的纖毛;如5次中有3次抬腿,則返回低一級克數的纖毛,直到每5次測試中有3次抬腿。能夠引起3/5次抬腿的最低vonFrey纖毛的克數被定義為PWT值。同樣方法測定另一側后爪。1.6骨質破壞標準在大鼠脛骨接種腫瘤細胞制備模型后,為了確定腫瘤生長對骨質的破壞,PID的5、17、26d分別對大鼠模型側和對側后肢進行了X線檢測。水合氯醛(300mg/kg,腹腔注射)麻醉后,將大鼠置于X射線機(柯達,意大利)前,暴露在30kV強度的X射線下1min,然后底片在顯影劑(KonicaSRX-101)下顯影。根據Honore等制訂的骨質破壞標準,對放射學影像進行評分:0分,正常骨結構,沒有任何破壞;1分,有骨破壞的小坑(1~3個);2分,骨破壞小坑增加(4~6個),并且骨髓質有缺失;3分,骨髓質有缺失并且骨皮質有侵蝕和糜爛;4分,非骨皮質的全層缺損;5分,非骨皮質的全層缺損和出現移位的骨折。1.7統(tǒng)計學處理方法數據用xˉ±sxˉ±s表示,均值間差異的顯著性檢驗用Sigmastate統(tǒng)計軟件進行,處理前后行為學反應的時間過程采用雙因素方差分析(twowayANOVA),并定義P<0.05為顯著性界值。2結果2.1各組大鼠術后生長情況接種Walker256乳腺癌細胞的模型鼠共計52只,其中有腫瘤細胞生長的共35只,成瘤率為67.3%;7只大鼠實驗過程中死亡,最終納入研究的共28只,占總數的53.8%。模型鼠術后2周內生長狀態(tài)良好,其中24只(占85%)從術后15~18d開始,陸續(xù)出現模型側后肢不能負重,表現為足外翻;另4只(占15%)術后19~21d出現模型肢足外翻。足外翻后不久,接種部位腫脹,其后4~6d出現輕度惡病質,隨著惡病質體征加重,最終導致全身衰竭或盆腔、腹腔廣泛轉移而死亡。25只模型鼠(占90%)從出現痛敏到死亡的時間為6~9d,3只模型鼠(占10%)為10~12d。假手術組大鼠存活良好,活動如常。模型組和假手術組大鼠術后體重變化如圖1所示:初期兩組體重無差異,PID15d后,模型組的體重增長慢于假手術組,之后差距更明顯(P<0.05或P<0.01)。2.2大鼠疼痛行為的模型2.2.1最大變化無變化的情況,即除雜0整個測試觀察期內,正常組和假手術組大鼠后肢行走痛行為評分均無變化,均為0;模型組大鼠和上述兩組相比差異有顯著的統(tǒng)計學意義,且隨著腫瘤細胞的生長,局部組織腫脹日益明顯,15d后痛行為評分越來越高(P<0.05,P<0.01,圖2)。2.2.2輻射熱痛覺能力正常組和假手術組大鼠術后各時間點組內比較,雙側后肢對輻射熱痛覺閾值PWL均無明顯改變。模型組大鼠雖在早期(前15d)模型側與對側后肢PWL值無統(tǒng)計學差異,但模型側后肢負重力下降;大約PID21d開始,表現為輻射熱痛覺過敏期,持續(xù)約2~3d,該時期組間熱痛覺閾值相比差異顯著(P<0.01,圖3A);過敏期后,模型側PWL熱痛覺閾值略有上升,但仍低于基礎值(P<0.05)。2.2.3兩組比較結果假手術組和正常組對機械刺激的PWT值在術后各時間點組內比較無顯著性差異。模型側后肢機械痛過敏出現時間與輻射熱痛敏相似,時間短,持續(xù)2~3d(圖3B),組間機械痛覺閾值比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。2.3最大限度者為0分影像學資料顯示:PID的5d,模型組和假手術組均未發(fā)現骨破壞,評分均為0分;PID的17d,模型組出現明顯的骨皮質破壞征象,評分為(1.5±0.5)分;PID26d,模型組整個骨結構發(fā)生嚴重破壞,表現為多處骨皮質缺失,平均為(4±0.5)分,假手術組全過程一直為0分(圖4)。3大鼠軟骨骨癌痛模型構建目前研究癌痛機制主要以骨癌痛模型為主。在實際臨床病例觀察中,腫瘤細胞轉移到骨或原發(fā)腫瘤在骨內,都會出現劇烈的疼痛;并且隨著骨質的破壞,疼痛程度加劇。一般易發(fā)生骨轉移的腫瘤有肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等。最易發(fā)生骨轉移的部位是胸椎、腰椎和骨盆。所以,臨床中胸椎、腰椎是晚期肺癌、乳腺癌的高發(fā)轉移部位;骨盆是前列腺癌的高發(fā)轉移部位。一般而言,動物模型應和臨床征象保持一致才能更好揭示病理現象產生的機制。因此,構建穩(wěn)定、有效的動物模型是目前癌痛研究的首要任務。近年來,國內外學者已做了大量工作。最早有學者將Walker256細胞通過靜脈注入大鼠血管里,但是因為個體免疫狀態(tài)的差異,致瘤的部位無法固定,且待研究大鼠的生命狀態(tài)極不穩(wěn)定,無法系統(tǒng)地長時間進行觀察。1999年,美國Manyth教授等率先在小鼠股骨建立骨癌痛模型,隨后展開了一系列的行為學、形態(tài)學和藥理學研究。2002年英國的Medhurst等運用MRMT-1大鼠乳腺癌細胞構建大鼠脛骨癌痛模型,并迅速在美國、日本和韓國得到了復制。2005年,美國科研人員用大鼠前列腺癌細胞構建成功大鼠脛骨骨癌痛模型,但上述腫瘤細胞在國內不易得到。本課題實驗了好幾種品系的大鼠腫瘤細胞,最終選擇Walker256大鼠乳腺癌腹水瘤細胞,原因為其穩(wěn)定的成瘤率,能表現出許多與人類骨癌痛相似的體征,如自發(fā)痛、觸發(fā)痛及痛覺過敏等。本研究結果顯示,模型鼠模型側后肢在植入瘤細胞12d后出現自由行走疼痛,15d痛行為評分非常顯著高于正常鼠和假手術鼠(P<0.01);同時,模型鼠模型側后肢對熱刺激反應痛覺閾值和對機械刺激痛覺閾值分別在造模21d和18d后明顯低于正常鼠和假手術鼠(P<0.01),也明顯低于模型肢對側后肢(P<0.05)。同時顯示,該模型大鼠的熱痛覺閾值和機械痛覺閾值測定容易,模型大鼠自由行走痛行為學評分易于篩選,這些都表明用Walker256乳腺癌腹水瘤細胞可以成功構建大鼠脛骨骨癌痛模型。總之,該模型有以下特點:(1)表現出與人類骨癌痛相似的痛覺行為;(2)疼痛程度定量指標檢測容易,定量較精確;(3)模型制備成功率較高,制備過程比較容易,有較好的實用性。在建模過程中,本實驗總結了以下幾條重要經驗:(1)應選用棕黃色的Walker256腫瘤細胞腹水,避免使用血性腹水,否則會增加造模動物的死亡率,這可能與血型腹水中的腫瘤細胞致死率較高有關。(2)切不可在皮下組織或肌肉過多的部位鉆孔,要盡量減少鉆孔和探查骨髓腔,以減少對正常骨結構的破壞,確保骨髓腔通暢;腫瘤細胞注入后,須用骨臘封口,并用酒精殺死遺留在骨外的腫瘤細胞,避免腫瘤在骨外生長產生假陽性結果;同時注意預防感染。(3)嚴格控制注入的腫瘤細胞數量。根據預實驗觀察,大鼠脛骨骨髓腔容積約為15μl,因此將注入瘤細胞量也定為15μl。注入后看到反流現象是腫瘤細胞進入骨髓腔的確切指標。(4)實驗中每只大鼠接種腫瘤細胞后出現痛敏現象的時間