應用雙啟動寡核苷酸引物技術建立檢測蚊媒病毒的多重r-pcr方法

應用雙啟動寡核苷酸引物技術建立檢測蚊媒病毒的多重r-pcr方法

動物疾病是由吸血動物和動物抓傷的病毒。其中100多種可能導致人類疾病，而且嚴重病例會導致死亡。本研究中日本腦炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黃熱病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼羅病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯腦炎病毒(St.LouisEncephalitisVirus,SLEV)和登革病毒(Denguevirus,DV)均屬于蚊媒病毒,主要由庫蚊和伊蚊傳播。目前我國除JEV和DV外,其他3種病毒尚未出現(xiàn),但是庫蚊和伊蚊在我國分布廣泛,為其傳入提供了方便。因而,同時迅速、準確地對蚊媒病毒的感染和混合感染做出檢測具有重要意義。多重RT-PCR技術對于混合性感染的疾病,特別是具有相似臨床癥狀和流行病學特征的病原體的診斷方面意義很大,可以降低實驗成本,提高實驗效率。近年來,一種基于雙啟動寡核苷酸引物(dualprimingoligonucleotide,DPO)的多重RT-PCR技術開始興起,既可保證擴增的特異性,又可大大提高擴增效率,為多重PCR技術的應用提供了新的前景。本研究應用DPO引物技術初步建立了檢測JEV、YFV、WNV、SLEV和DV5種蚊媒病毒的多重RT-PCR方法,為檢測蚊子所攜帶的一種或多種病毒提供了迅速、準確而可靠的診斷方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1材料和質(zhì)粒日本腦炎病毒SA-14-14-2疫苗株來自武漢生物制品研究所、黃熱病毒減毒活疫苗來自北京天壇生物制品公司,pcD-NA5-WNV-JMEW-RNA(NY99-eqhs株)、pcD-NA5-SLEV-JMEH-RNA(Hubbard株)質(zhì)粒和pMD19-DV質(zhì)粒由本實驗室保存。1.1.2pcr檢測dnaTaq酶及PCR緩沖液(Takara,大連)、DNA-marker(Takara,大連)、RNA提取試劑盒(QIAGEN,Germany)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PROMEGA,USA)。1.1.3改進病毒引物的設計和合成通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)查詢已發(fā)表的JEV、YFV、WNV、DV和SLEV毒株的全基因序列,利用DNAStar軟件分別比對5種病毒代表株的基因序列,找到病毒的序列保守區(qū)。在5種病毒的保守區(qū)域,依照DPO引物的設計原則,利用PrimerPremier5.0軟件分別設計針對五種病毒的DPO引物并由上海生工生物技術有限公司合成。引物設計目標基因及預期擴增產(chǎn)物大小見表1。1.2方法1.2.1算考貝數(shù)質(zhì)粒pcDNA5-SLEV-JMEH和pcDNA5-WNV-JMEW質(zhì)粒按體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行體外轉(zhuǎn)錄,測定RNA濃度,計算拷貝數(shù)分別為2.6×1012copies/μl和2.3×1012copies/μl;根據(jù)武漢生物制品研究所及北京天壇生物制品公司提供的JEV和YFV病毒液的數(shù)據(jù),經(jīng)公式計算,JEV的滴度為5.0×106PFU/ml;YFV的滴度為4.5×105PFU/ml;以DV-1型病毒為模板,制備DV質(zhì)粒,測定DV質(zhì)粒濃度為48.2ng/μl,經(jīng)計算DV質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)為1.37×1010/μl。1.2.2rt-pcr擴增條件的優(yōu)化通過用單一引物檢測5種病毒的混合模板和混合引物檢測單一病毒模板來驗證引物的特異性,按常規(guī)PCR引物濃度等量混合五對引物以及5種病毒反轉(zhuǎn)錄后的cD-NA等量混合作為混合模板進行RT-PCR擴增反應。1.2.3多重RT-PCR體系最佳反應條件的優(yōu)化分別選擇5種病毒的一個適當稀釋度作為模板,等量混合,5種引物等量混合,RT-PCR反應條件和體系與單重RT-PCR反應相同。根據(jù)電泳結(jié)果,主要對引物濃度、Mg2+濃度和退火溫度進行優(yōu)化。1.2.4rt-pcr檢測取20μlJEV和YFV的病毒液10倍系列稀釋,稀釋度為10-1~10-6,分別取140μl用試劑盒提取RNA后RT-PCR檢測;取1μlpcDNA5-SLEV-JMEH-RNA和pcDNA5-WNV-JMEW-RNA體外轉(zhuǎn)錄后的RNA10倍系列稀釋,稀釋度為10-1~10-10,然后每個稀釋度分別取2μl作為模板直接RT-PCR檢測;取1μlpMD19-T-DV質(zhì)粒DNA10倍系列稀釋,稀釋度為10-1~10-9,由于體外轉(zhuǎn)錄的RNA模板和質(zhì)粒模板的DNA濃度較高,所以從10-4開始檢測;多重RT-PCR反應敏感性的測定在單重RT-PCR反應敏感性基礎上進行,并依次降低一個數(shù)量級進行篩選。1.2.5wnv-prm、sclev-cprm質(zhì)粒的提取分別取50只埃及伊蚊、三帶喙庫蚊和白蚊伊蚊加Trizol試劑制成勻漿,然后與WNV-prM、SLEV-CprM質(zhì)粒RNA、DV質(zhì)粒、JEV和YFV細胞培養(yǎng)液混合,靜置10min,短暫離心(8000g30s),取上清,直接提取RNA,然后進行多重-RT-PCR檢測。2結(jié)果2.1r-pcr反應擴增的特定試驗2.1.1擴增有效蛋白每種病毒的單一引物(終濃度為0.4μmol/L)只能擴增出相應病毒模板的目的條帶,與其他4種病毒不發(fā)生交叉反應,具有良好的特異性(圖1)。2.1.2混合索引檢測獨特的病毒模型2.2引物濃度和其他指標的濃度經(jīng)過優(yōu)化,確定最終反應條件:引物濃度:SLEV、YFV和WNV的引物濃度為0.4μmol/L,DV和JEV的引物濃度為0.8μmol/L;Mg2+濃度:1.5mmol/L;dNTP濃度:250μmol/L;退火溫度:50.0℃(圖3)。2.3抗凝劑靈敏度和rt-pcr檢測限的比較分別取10μlJEV、YFV、pcDNA5-SLEV-JMEH-RNA、pcDNA5-WNV-JMEW-RNA及pMD19-T-DV單重擴增反應后的產(chǎn)物,經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,依次最低能檢測到10-4、10-3、10-9、10-8和10-7稀釋度的相應病毒液,即靈敏度分別為500PFU/ml、450PFU/ml、2.3×104copies/μl、2.6×103copies/μl和1.37×103copies/μl,而五重DPO-RT-PCR反應JEV、YFV、SLEV、WNV和DV的檢測限均比單一病毒RT-PCR反應低一個數(shù)量級即靈敏度分別為5000PFU/ml、4500PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,電泳結(jié)果見圖4~6。2.4蚊的pcr檢測在3種不同種類的蚊RNA中添加陽性樣本,以陰性蚊的樣本作為對照,利用優(yōu)化好的多重PCR方法檢測蚊樣本。結(jié)果表明(圖7),陰性對照成立,3個樣本中的5種病毒均可檢出,且無非特異擴增反應。3po引物技術檢測本實驗針對JEV、YFV、WNV、SLEV及DV5種蚊媒病毒的同時檢測方法進行研究。其中,YFV、WNV及SLEV在我國尚未發(fā)現(xiàn),但隨著旅游業(yè)和國際貿(mào)易的發(fā)展,這幾種病毒傳入我國的可能性顯著增加。所以,在我國針對這幾種病毒的檢測研究,具有重要的意義。目前,國內(nèi)外學者已經(jīng)建立了利用RT-PCR檢測這幾種蚊媒病毒的方法,但是利用多重RT-PCR技術同時檢測多種蚊媒病毒國內(nèi)外報道很少。主要是因為在傳統(tǒng)的多重RT-PCR體系中,引物二聚體的形成以及引物與模板之間的錯配嚴重制約著多重RT-PCR的應用。DPO引物技術是近幾年發(fā)展起來的一種新的技術,研究主要集中在檢測病毒的復合感染等。LeeCS等在檢測臨床樣本中的豬流感病毒H1、H3、N1、N2不同亞型時,運用一步RT-PCR的方法與DPO引物技術相結(jié)合,取得了預期的結(jié)果。DPO引物是指將普通的引物分為2個獨立的部分:一部分是5’端,另一部分是3’端,5’端的堿基數(shù)要比3’端的堿基數(shù)多,即5’端的長度要長于3’端,而兩部分之間是有多聚次黃嘌呤(polyI)堿基連接的。由于次黃嘌呤堿基(I堿基)的氫鍵結(jié)合力較弱,所以相比較于其他堿基,I堿基的解鏈溫度低。DPO引物引導PCR擴增時,無論3’端或是5’端發(fā)生2個堿基以上的錯配,PCR擴增就不會繼續(xù)。因此,只有模板與特異性引物5’端和3’端均匹配時,PCR擴增才能進行,這樣就可以有效地阻斷非特異擴增,提高擴增效率。本研究在單個病毒RT-PCR的靈敏度檢測中,JEV與YFV的靈敏度分別為500PFU/ml和450PFU/ml與國內(nèi)外報道基本一致,WNV與SLEV質(zhì)粒RNA拷貝數(shù)檢測限分別為2.3×104copies/μl和2.6×103copies/μl,而DV質(zhì)?？截悢?shù)的檢測限也在1.37×103copies/μl,把拷貝數(shù)換算成PFU與JEV與YFV的靈敏度比較在同一水平。在蚊模擬添加實驗中,利用所建立