納米雄黃固體分散體的制備及體外溶出考察

納米雄黃固體分散體的制備及體外溶出考察

中藥雄黃的主要成分為as2s2和as4s4，以及少量as2o3和其他重金屬鹽。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，雄黃具有解毒、除濕、祛痰、瘧疾等作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,雄黃還具有抗腫瘤作用,大量文獻(xiàn)報(bào)道了中藥雄黃對(duì)惡性血液病、多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌及子宮頸癌前病變等的治療研究,其抗腫瘤機(jī)制包括誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖、促進(jìn)分化等。但雄黃的主要活性成分As2S2水溶性差,體內(nèi)難以吸收,導(dǎo)致其生物利用度低、臨床使用量大,從而影響了治療效果。納米技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用于提高雄黃的療效,近年的研究表明,經(jīng)納米化后,雄黃體現(xiàn)出更佳的抗腫瘤作用。同時(shí),雄黃到達(dá)納米級(jí)后也帶來(lái)了其他需要解決的問(wèn)題,粒徑減小,導(dǎo)致其比表面積增加,更加容易發(fā)生氧化反應(yīng)形成As2O3從而帶來(lái)毒性;另外,納米雄黃粉極易發(fā)生團(tuán)聚,限制了其臨床使用效果。本課題通過(guò)固體分散體技術(shù)來(lái)提高納米雄黃的抗氧化性,增加納米雄黃的穩(wěn)定性,降低其毒性的同時(shí)不影響其活性。1數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)行星式球磨機(jī)(PM100型,德國(guó)Rersch);原子吸收分光光度計(jì)(990AFG,北京普析通用有限公司);紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV765,上海精科);Sartorius天平(CP225D,德國(guó));5804R臺(tái)式離心機(jī)(EPPENDORF,德國(guó));NanoZS90Zetasizer粒徑/Zeta電位測(cè)定儀(Malvern,英國(guó));RC-806溶出度儀(天津天大天發(fā)科技有限公司);X-射線衍射儀(Rigaku,日本);eclipse80i數(shù)碼顯微鏡(日本Nikon);DS-Ri1數(shù)碼成像系統(tǒng)(日本Nikon)。雄黃(湖南石門(mén));砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(用As2O3配制,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心);聚乙二醇6000(PEG6000,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);泊洛沙姆188(F68,德國(guó)巴斯夫有限公司);其余試劑均為分析純。硫脲-抗壞血酸溶液:稱(chēng)取硫脲、抗壞血酸各5g,用蒸餾水溶解并定容至100mL,配成50g·L-1的溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。硼氫化鉀溶液:稱(chēng)取硼氫化鉀5g溶于20g·L-1氫氧化鉀溶液500mL中,配成10g·L-1的溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。稀鹽酸:取鹽酸234mL,加水稀釋至1000mL,即得。碘化鉀試液:取碘化鉀16.5g,加水使溶解成100mL,即得。本液應(yīng)臨用前新鮮配制。酸性氯化亞錫試液:取氯化亞錫20g,加鹽酸使溶解成50mL,濾過(guò),即得。本液配成后3個(gè)月即不適用。二乙基二硫代氨基甲酸銀試液:取二乙基二硫代氨基甲酸銀0.25g,加氯仿適量與三乙胺1.8mL,加氯仿至100mL,攪拌使溶解,放置過(guò)夜,用脫脂棉濾過(guò),即得。本液應(yīng)置棕色玻璃瓶?jī)?nèi),密塞,置陰涼處保存。標(biāo)準(zhǔn)砷溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取As2O30.132g,置1000mL量瓶中,加20%氫氧化鈉溶液5mL溶解后,用適量的稀鹽酸中和,再加稀鹽酸10mL,用水稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。臨用前,精密量取貯備液10mL,用水稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL相當(dāng)于1μg的As)。上述試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。2方法2.1as2o3分析的建立采用2010年版《中國(guó)藥典》砷鹽檢查法測(cè)定中的二乙基二硫代氨基甲酸銀法。2.1.1ddc-ag-l-1標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取As2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液1,5,10,15,20mL(相當(dāng)于1,5,10,15,20μg的As)分別放入100mL標(biāo)準(zhǔn)磨口錐形瓶中,加鹽酸5mL與水21mL,再加碘化鉀試液5mL與酸性氯化亞錫試液5滴,在室溫放至10min后,加鋅粒2g,立即安上裝有醋酸鉛棉導(dǎo)氣管的瓶塞,導(dǎo)管通入盛有5mLDDC-Ag液的吸收管中,反應(yīng)45min,取出,用氯仿補(bǔ)至5mL,混勻,置lcm吸收池中以二乙基二硫代氨基甲酸銀液為空白,用分光光度計(jì)在510nm處測(cè)定吸光度,以吸光度(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X,mg·L-1)進(jìn)行線性回歸,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.0128X+0.0026(r=0.9986),線性范圍0.0~20.0mg·L-1。2.1.2稀鹽酸溶液破碎精密稱(chēng)定樣品粉末0.2g,加稀鹽酸20mL,攪拌30min,濾過(guò),殘?jiān)孟←}酸洗滌2次,每次10mL,攪拌10min。洗液與濾液合并,置100mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,精密量取2mL,其余操作同As2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.2as2s2分析采用氫化物原子吸收分光光度法測(cè)定。2.2.1燃燒高度及位置測(cè)定波長(zhǎng)193.7nm;光譜帶寬0.4nm;負(fù)高壓535V;燈電流6mA;燈元素As;燃?xì)饬髁?00mL·min-1;燃燒器高度10mm;燃燒器位置3mm;載流0.9%鹽酸。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備2.3黃納米材料和性能2.3.1球磨法制備納米雄黃按文獻(xiàn)報(bào)道方法,采用高能球磨機(jī)濕磨法制備納米雄黃。將塊狀雄黃粉碎過(guò)篩,得粗顆粒,按球料比40∶1投入至球磨罐中,加入飽和十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)10mL作為球磨介質(zhì),球磨轉(zhuǎn)速400r·min-1,正轉(zhuǎn)30min,停3min,反轉(zhuǎn)30min,球磨12h取出得到納米雄黃。2.3.2研缽加標(biāo)研磨法采取水飛法對(duì)納米雄黃進(jìn)行炮制去毒。取10g納米雄黃置研缽中,加蒸餾水5mL,研磨5min呈糊狀,再加蒸餾水100mL攪拌1min,靜置2min,傾取混懸液,下沉的粗粉繼續(xù)研磨,如此反復(fù)操作11次,最后用剩余水沖洗研缽,合并各次混懸液,靜置24h,傾去上清液,抽濾即可。2.3.3醇中ma基于ma基于mavern粒徑的檢測(cè)取少量納米雄黃,超聲分散于適量乙二醇中,利用Malvern粒徑測(cè)定儀測(cè)定其粒徑;另取少量納米雄黃分散于去離子水中進(jìn)行Zeta的測(cè)定。2.3.4透射電鏡觀察利用透射電鏡對(duì)納米雄黃的外觀形態(tài)進(jìn)行觀察。納米雄黃經(jīng)適量蒸餾水稀釋后,取適量滴加至銅網(wǎng)上,自然干燥約10min,放至透射電鏡下進(jìn)行觀察。2.4樣品的制備2.4.1納米雄黃固體分散體的制備采用熔融法制備納米雄黃固體分散體。按設(shè)計(jì)比例(質(zhì)量比1∶5)稱(chēng)取經(jīng)炮制的納米雄黃粉和載體材料(PEG6000,F68),先將載體材料置蒸發(fā)皿中,水浴加熱至一定溫度熔化后,投入納米雄黃粉,高剪切攪拌一定時(shí)間,迅速將樣品轉(zhuǎn)移至冰浴冷卻,于真空干燥箱內(nèi)干燥過(guò)夜,粉碎后過(guò)80目篩,得到納米雄黃固體分散體,最后放入干燥器中室溫陳化48h備用。2.4.2物理混合物的制備將納米雄黃與載體材料PEG6000,F68分別按質(zhì)量比1∶5于研缽中研細(xì),混勻后過(guò)80篩,即得,備用。2.5固體分散體的識(shí)別2.5.1x-射線衍射分析將納米雄黃,PEG6000,F68,物理混合物及固體分散體進(jìn)行X-射線衍射分析。輻射源Cu-Ka;掃描范圍2θ2°~50°;掃描速度5°·min-1。2.5.2物理混合物及固體分散體的光學(xué)顯微觀察將納米雄黃,PEG6000,F68,物理混合物及固體分散體用甘油分散于載玻片上,蓋上蓋玻片后,置于光學(xué)顯微鏡下(物鏡40倍,目鏡10倍)觀察。2.6穩(wěn)定性研究2.6.1納米雄黃粒度穩(wěn)定將制備的納米雄黃室溫下避光存放于干燥器中,于第1,2,3,10天分別取樣,測(cè)定其粒徑。2.6.2穩(wěn)定性測(cè)定:1.2o3不同水將雄黃粗粉、納米雄黃、納米雄黃的PEG6000固體分散體(質(zhì)量比1∶5)、納米雄黃的F68固體分散體(質(zhì)量比1∶5)室溫下存放至干燥器中(不避光),于第7天取樣,按2.1.2項(xiàng)下條件測(cè)定As2O3含量。2.7外溶2.7.1溶出介質(zhì)的選擇分別精密稱(chēng)取雄黃粗粉和納米雄黃各1g,納米雄黃的PEG6000固體分散體(質(zhì)量比1∶5)和納米雄黃的F68固體分散體(質(zhì)量比1∶5)適量(均含納米雄黃1g),分別置于往復(fù)式水浴恒溫振蕩器中,加人工胃酸溶液60mL作為溶出介質(zhì),(37±0.5)℃水浴震蕩36h后,取樣10mL,離心取上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾,精密量取100μL置10mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,按2.2.1項(xiàng)下條件測(cè)定As2S2含量并計(jì)算其砷溶出量。2.7.2溶出介質(zhì)中as2s2參考文獻(xiàn)方法對(duì)各組雄黃的砷溶出速度進(jìn)行考察。精密稱(chēng)取雄黃粗粉和納米雄黃各3g,納米雄黃的PEG6000固體分散體(質(zhì)量比1∶5)和納米雄黃的F68固體分散體(質(zhì)量比1∶5)適量(均含納米雄黃3g),分別置于溶出試驗(yàn)儀中,加人工胃酸180mL作為溶出介質(zhì),采用小杯法,(37±0.5)℃,攪拌轉(zhuǎn)速120r·min-1,分別于5,10,15,20,30,40,50,60,80min抽取樣品液2mL,并補(bǔ)加同溫空白介質(zhì)2mL,樣品離心后取上清液用0.45μm濾膜濾過(guò),精密量取100μL置10mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,按2.2.1項(xiàng)下條件測(cè)定As2S2含量并繪制溶出曲線。3結(jié)果3.1超聲分散在測(cè)定粒徑時(shí)為了起到更好的分散效果,本研究將納米雄黃超聲分散于適量乙二醇中。結(jié)果見(jiàn)圖1,納米雄黃的平均粒徑為(85.4±3.5)nm,Zeta電位為(-34.3±1.7)mV,表明納米雄黃粒子表面帶負(fù)電。3.2研究納米雄黃形態(tài)納米雄黃的透射電鏡(TEM)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。納米雄黃近球型,分布均勻。3.3體體晶體有微觀晶峰X(qián)RD試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3,納米雄黃的結(jié)晶衍射峰明顯,2種物理混合物亦出現(xiàn)微弱衍射峰,固體分散體的結(jié)晶衍射峰均消失或減弱,峰形和載體基本一致,提示在形成固體分散體以后,由于載體對(duì)藥物的抑晶作用,使藥物以無(wú)定形狀態(tài)高度分散在載體材料中,還有一小部分可能是以微晶狀態(tài)存在。3.4peg關(guān)注納米雄黃與載體材料的混合顯微觀察結(jié)果見(jiàn)圖4,納米雄黃為棕黃色微晶,PEG6000為不規(guī)則形狀的結(jié)晶粉末,F68為球狀或不規(guī)則顆粒,在PEG6000及F68與納米雄黃的物理混合物中分別見(jiàn)到納米雄黃與載體材料只是簡(jiǎn)單混合,未發(fā)生變化。納米雄黃固體分散體均為干燥后研碎獲得的粉末,因此呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀,在光學(xué)顯微鏡下可以清楚地看到納米雄黃的棕黃色微晶分散在無(wú)色透明的載體當(dāng)中,納米雄黃與載體材料均勻地融合在一起,納米雄黃可能以無(wú)定形式分散于載體材料中。3.5納米雄黃的粒徑納米雄黃粒徑穩(wěn)定性考察結(jié)果表明,隨著時(shí)間的推移,納米雄黃粒徑有逐漸增大的趨勢(shì),10d后平均粒徑(218.5±4.2)nm,已達(dá)到原來(lái)的2倍以上,證明納米雄黃在儲(chǔ)藏過(guò)程中具有團(tuán)聚現(xiàn)象。3.6納米雄黃固體分散體中as2o3含量的測(cè)定各組雄黃As2O3含量穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表1,結(jié)果表明納米雄黃中As2O3含量在7d內(nèi)較其他3組明顯增加,納米雄黃固體分散體中As2O3的含量在7d內(nèi)與納米雄黃組和雄黃粗粉組相比較為穩(wěn)定。證明雄黃納米化后容易發(fā)生氧化現(xiàn)象,通過(guò)固體分散體技術(shù)將納米雄黃包裹后可以避免納米雄黃直接暴露于空氣和光照中,從而起到增加穩(wěn)定性的作用,而用F68制備的固體分散體能更好地提高納米雄黃的抗氧化性,增加納米雄黃的穩(wěn)定性。3.7雄黃納米化前后砷溶出量的變化雄黃粗粉、納米雄黃和納米雄黃固體分散體中As2S2溶出量的結(jié)果見(jiàn)表2,結(jié)果表明將雄黃納米化后砷溶出量可達(dá)常規(guī)雄黃粗粉中砷溶出量的7.7倍,納米雄黃的PEG6000,F68固體分散體中砷溶出量顯著增加,納米雄黃的F68固體分散體的砷溶出量增加更為明顯。3.8不同固體分散體對(duì)納米雄黃砷溶出量的影響雄黃粗粉、納米雄黃及其固體分散體中As2S2溶出曲線見(jiàn)圖5。雄黃粗粉中As2S2的溶出速度較慢,20min前幾乎沒(méi)有溶出,80min累積溶出量勉強(qiáng)達(dá)到0.1mg·g-1。與雄黃粗粉相比,納米雄黃中As2S2的溶出速度較快,10min時(shí)溶出量即超過(guò)0.1mg·g-1,80min累積溶出量為雄黃粗粉的9.4倍。而2種固體分散體均可大大提高納米雄黃的砷溶出量,F68固體分散體的效果更好,在80min時(shí)PEG固體分散體和F68固體分散體的砷溶出量分別達(dá)到4.347,7.354mg·g-1,是納米雄黃的5.0,8.5倍,表明固體分散體可以顯著提高納米雄黃的砷溶出量;而在5min時(shí)2種固體分散體的砷溶出量已達(dá)0.371,0.594mg·g-1,分別是納米雄黃的4.3,6.9倍,表明本試驗(yàn)制備的固體分散體不僅提高了納米雄黃的砷溶出量,還提高了初期的溶出速度,證明固體分散技術(shù)確是提高難溶性藥物溶出度的有效手段。4納米雄黃體外溶出條件的確定目前,國(guó)內(nèi)有很多專(zhuān)家開(kāi)展了納米雄黃的研究。通過(guò)納米化,可改善雄黃的溶出性能,提高其生物利用度,從而增加其臨床療效。但是對(duì)于納米雄黃的研究過(guò)程中忽略了2個(gè)比較重要的方面:在球磨的過(guò)程中,機(jī)械力傳輸了大量的動(dòng)能給納米雄黃,導(dǎo)致納米雄黃具有二次團(tuán)聚的可能;雄黃被納米化后理化性質(zhì)發(fā)生改變,尤其是粒徑大幅減小,暴露于空氣或光照中的雄黃粒子表面積會(huì)明顯增加,這就會(huì)導(dǎo)致雄黃主要成分As2S2容易氧化成As2O3