hplc法測(cè)定人血漿中伊立替康及其代謝物喜樹堿的濃度

hplc法測(cè)定人血漿中伊立替康及其代謝物喜樹堿的濃度

伊利洋康是一種半合成喜樹堿衍生物。它可以特異性地抑制dna的異構(gòu)酶，阻止異構(gòu)酶恢復(fù)斷裂的dna鏈，并抑制細(xì)胞分裂。在臨床研究中,發(fā)現(xiàn)伊立替康對(duì)晚期直腸癌有肯定療效。在CPT-11的代謝過(guò)程中,被肝臟、腸道或血漿中的羧酸酯酶水解,生成一個(gè)有活性的代謝物,即7-乙基-10-羥基喜樹堿(以下簡(jiǎn)稱SN-38)。其余代謝通路則是主要通過(guò)CYP3A4進(jìn)行,代謝產(chǎn)物包括通過(guò)CYP3A4代謝產(chǎn)生的APC、NPC等等。在CPT-11的一系列代謝物的活性研究中,發(fā)現(xiàn)SN-38活性較高,其他代謝物則活性低或無(wú)活性。伊立替康及SN-38在臨床上能產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng),因此建立一套簡(jiǎn)便精確的CPT-11與SN-38測(cè)定方法十分重要。目前主要的檢測(cè)手段是通過(guò)高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定伊立替康,但一般不檢測(cè)活性代謝物SN-38。因使用質(zhì)譜成本較高,在臨床上暫時(shí)無(wú)法大規(guī)模推廣使用,且未測(cè)定SN-38。因此建立一種簡(jiǎn)單方便、又滿足檢測(cè)要求的測(cè)定方法更具實(shí)際意義。本文建立了同時(shí)檢測(cè)CPT-11與其活性代謝物SN-38的HPLC方法,簡(jiǎn)便精確,可以在臨床上推廣使用,現(xiàn)報(bào)道如下。1方法1.1藥物、試劑和儀器Waters1525二元高效液相泵;Waters2475多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器;Waters2707自動(dòng)進(jìn)樣器(WatersCorporation);Breeze2HPLCSystem。伊立替康(化學(xué)對(duì)照品,SIGMA-ALDRICH,批號(hào)059K1163);SN-38(化學(xué)對(duì)照品,SIGMA-ALDRICH,≥98%);喜樹堿(化學(xué)對(duì)照品,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)100532-200401);醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)T20090629,≥99.5%);醋酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,≥98.0%);甲醇(FisherScientific,99.9%);乙腈(FisherScientific,99.9%)。1.2流動(dòng)相、梯度配比色譜柱:Luna5uCN100A(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱(Phenomenex);流動(dòng)相:醋酸銨緩沖鹽(50mmol·L-1,0.3%醋酸)與乙腈梯度洗脫。見(jiàn)表1。梯度配比:A:乙腈,B:醋酸銨緩沖鹽(50mmol·L-1,0.3%醋酸);進(jìn)樣量:10μL;柱溫:40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)=368nm,發(fā)射波長(zhǎng)=CPT-11=432nm,SN-38=535nm。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以0.01mol·L-1鹽酸液-乙腈(2∶3)為稀釋液,CPT-11,SN-38與內(nèi)標(biāo)CPT用DMSO溶解后用稀釋液稀釋。CPT-11與SN-38以濃度比24∶1混合為工作溶液,濃度分別為:CPT-11469,938,1875,3750,7500,15000,30000,60000nmol·L-1;SN-3820,39,78,156,312,625,1250,2500nmo·L-1。分別取上述工作溶液10μL置于1.5mLEP管中,加入90μL空白人血漿,渦旋混合;加入10μL的內(nèi)標(biāo)溶液(CPT1μmol·L-1),渦旋混合;然后加入10%高氯酸-乙腈(1∶2)沉淀劑90μL,振蕩混勻,以12000r·min-1的速度離心10min,取上清溶液備用。即制得血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線8個(gè)點(diǎn)濃度范圍為:CPT-1146.9～6000.0nmol·L-1;SN-382.0～250.0nmol·L-1。2結(jié)果2.1色譜圖的測(cè)定在上述實(shí)驗(yàn)條件下,CPT-11,CPT與SN-38的保留時(shí)間分別為:SN-38(4.8min),CPT(5.3min),CPT-11(9.5min),分離度R=1.68符合要求。色譜圖見(jiàn)圖1。另取5份空白血漿做空白對(duì)照試驗(yàn),雜質(zhì)峰對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)無(wú)干擾,專屬性較好。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線方程在本實(shí)驗(yàn)方法下,SN-38定量范圍為2.0～250.0nmol·L-1,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.034+0.036X(W=1/C),r=0.998。CPT-11的定量范圍為46.9～6000.0nmol·L-1,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.116+0.013X(W=1/C),r=0.998。2.3血漿中藥物濃度檢測(cè)定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn),其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%～120%范圍內(nèi),RSD應(yīng)小于20%。我們考察樣品濃度SN-38為2.0nmol·L-1,CPT-11為46.9nmol·L-1,低于4個(gè)半衰期時(shí)血漿中藥物濃度。發(fā)現(xiàn)SN-38準(zhǔn)確度為(99.3±15.6)%,RSD為15.67%。CPT-11的準(zhǔn)確度為(94.8±3.1)%,RSD為3.27%,且S/N>10。因此可認(rèn)為本方法的定量下限:SN-38為2.0nmol·L-1,CPT-11為46.9nmol·L-1。2.4精密度與準(zhǔn)確度本實(shí)驗(yàn)中共考察3個(gè)分析批的批內(nèi)精密度、批間精密度以及所有樣品的準(zhǔn)確度,發(fā)現(xiàn)血漿樣品在L(CPT-1193.8nmol·L-1,SN-383.9nmol·L-1),M(CPT-11750.0nmol·L-1,SN-3831.0nmol·L-1),H(CPT-113000.0nmol·L-1,SN-38125.0nmol·L-1)3個(gè)濃度點(diǎn)的批內(nèi)與批間精密度以及準(zhǔn)確度均符合測(cè)定要求結(jié)果見(jiàn)表2。2.5反復(fù)凍融穩(wěn)定性取低,中,高3個(gè)濃度點(diǎn)的血漿樣品考察其穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)血漿樣品在室溫下放置8h穩(wěn)定性無(wú)顯著變化。血漿樣品在-20～18℃溫度下反復(fù)凍融穩(wěn)定性無(wú)顯著變化。血漿樣品在-70℃條件下凍存1周后,穩(wěn)定性無(wú)顯著變化。處理后血漿樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性無(wú)顯著變化。2.6提取回收率驗(yàn)證測(cè)定低,中,高3個(gè)濃度點(diǎn)各5份血漿樣品的樣品峰面積平均值并與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積比較,得到提取方法的提取回收率。結(jié)果表明SN-38的提取回收率為(60±3)%,CPT-11的提取回收率為(50±3)%。3討論3.1流動(dòng)相的確定選用Luna5uCN100A為色譜柱,以標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例。用甲醇與醋酸銨緩沖鹽按一定比例作為流動(dòng)相,峰形與保留時(shí)間均不理想,梯度洗脫也無(wú)明顯改善。而用乙腈與醋酸銨緩沖鹽為流動(dòng)相時(shí),則結(jié)果較為理想。利用調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例來(lái)減少血漿樣品中雜質(zhì)峰對(duì)測(cè)定的干擾,在比較45∶55,50∶50和55∶45等度洗脫以及數(shù)種梯度洗脫方式后,發(fā)現(xiàn)以35∶65～50∶50～65∶35的梯度洗脫方式分離效果最為理想。3.2提取回收率及檢測(cè)限試驗(yàn)考察了:(1)甲醇;(2)10%高氯酸;(3)10%高氯酸-甲醇(1∶2);(4)10%高氯酸-乙腈(1∶2)4種沉淀劑的提取回收率,發(fā)現(xiàn)以甲醇的提取回收率最高,10%