熒光素酶實(shí)驗(yàn)-第五篇

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測（五）關(guān)于雙熒光素酶報(bào)告基因檢測中遇到的問題及解決措施問題1：為什么要用熒光素酶實(shí)驗(yàn)來做檢測，不用其他報(bào)告基因來做，GFP可以嗎？采用熒光素酶來做實(shí)驗(yàn)是由其自身的優(yōu)勢所決定的：（1）蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產(chǎn)生報(bào)告活性；（2）在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細(xì)胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光；（3）檢測快速，每個(gè)樣品只需幾秒鐘。以上優(yōu)勢使其成為廣大科研工作者做相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的首選，其他報(bào)告基因由于種種缺陷一般不作為研究手段。問題2：雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)為什么要加luciferase底物（luciferin）？因?yàn)槲覀儤?gòu)建的雙熒光素酶系統(tǒng)是催化酶，要發(fā)光需要底物，催化酶催化底物才能產(chǎn)生熒光。問題3：為什么要用兩個(gè)熒光素酶，海腎熒光素酶的作用是什么？通過利用熒光素酶與其底物結(jié)合發(fā)生的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，可以將目標(biāo)基因的調(diào)控序列克隆到螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase）基因的上游，從而創(chuàng)建一個(gè)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。為了降低實(shí)驗(yàn)中如細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量、活性差異，以及轉(zhuǎn)染和細(xì)胞裂解效率等內(nèi)在變量對結(jié)果的影響，使用含有海洋蟲熒光素酶（Renillaluciferase）基因的質(zhì)粒作為內(nèi)部對照。這樣，通過共轉(zhuǎn)染這兩種報(bào)告基因到細(xì)胞中，可以確保獲得的轉(zhuǎn)錄活性數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定，減少實(shí)驗(yàn)條件波動(dòng)所帶來的影響。問題4：轉(zhuǎn)染成功如何判斷？在共轉(zhuǎn)染多個(gè)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，通過測定最終的熒光素酶（luciferase）活性值，可以判斷3'UTR質(zhì)粒和Renilla質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。然而，對于miRNA質(zhì)?；騧iRNA模擬物（mimic），其轉(zhuǎn)染效果不能僅從熒光素酶讀數(shù)直接判斷。為了驗(yàn)證miRNA的轉(zhuǎn)染效果，可以采取以下幾種方法：(1)如果轉(zhuǎn)入的miRNA帶有如GFP等熒光標(biāo)記，可在細(xì)胞裂解前通過顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光情況；(2)若轉(zhuǎn)入的miRNA沒有熒光標(biāo)記，則可以通過進(jìn)行miRNA的定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組中miRNA的表達(dá)差異，以此判斷其過表達(dá)情況；(3)另外，可以設(shè)置一個(gè)帶熒光標(biāo)記的質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染效率的參照，與目標(biāo)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從而間接評估整個(gè)實(shí)驗(yàn)批次中的轉(zhuǎn)染效率。問題5：如何判斷實(shí)驗(yàn)體系無異常？可以從以下幾個(gè)方面來考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性：對照的2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2luc表達(dá)情況應(yīng)無顯著差異；轉(zhuǎn)染正常，質(zhì)?；騧imic確保成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞；luc檢測值在儀器檢測線性范圍內(nèi)。問題6：陰性結(jié)果如何理解？在確保實(shí)驗(yàn)體系無異常的前提下，如果最終檢測到的結(jié)果是陰性結(jié)果，則基本可以判斷目的miRNA不能直接調(diào)控靶基因的表達(dá)，不死心的話就再做一次問題7：實(shí)驗(yàn)體系是否可以優(yōu)化？該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)在細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化可通過調(diào)整共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例或調(diào)整轉(zhuǎn)染體系來進(jìn)行，設(shè)置合理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量梯度，觀察microRNA對靶基因的抑制是否存在劑量效應(yīng)或是否存在變化趨勢的一致性，從而使結(jié)論更加可靠。問題8：使用mimics的一些問題？可以使用mimics來做實(shí)驗(yàn)，其實(shí)mimics就是體外合成的成熟體miRNA，同樣可以反轉(zhuǎn)錄，用qRT-PCR來檢測表達(dá)量，但是大家應(yīng)該很少看到有文章把mimics的過表達(dá)量PCR結(jié)果放出來的吧，那是因?yàn)閙imics的過表達(dá)通常在數(shù)萬到數(shù)十萬倍，miIRNA通常會(huì)靶向結(jié)合許多靶基因，這么強(qiáng)的外源過表達(dá)肯定會(huì)引起嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，給審稿人把柄質(zhì)疑你嗎？對于這種找抽的行為大家肯定是積極規(guī)避的。質(zhì)粒介導(dǎo)的miRNA過表達(dá)由于是模擬了前體在生物體內(nèi)的剪切，其過表達(dá)通常在數(shù)十倍到數(shù)百倍，可能引起的脫靶效應(yīng)遠(yuǎn)沒有mimics嚴(yán)重。問題9：其他調(diào)控方法是否還有其他方法驗(yàn)證miRNA對靶基因表達(dá)的調(diào)控？驗(yàn)證miRNA對靶基因的調(diào)控，也可直接檢測miRNA過表達(dá)或下調(diào)表達(dá)后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的變化（WesternBlot方法）。問題10：關(guān)于熒光的問題-熒光值過高熒光值過高可能會(huì)超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數(shù)在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：1.減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；2.細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測。（注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實(shí)的表達(dá)水平，否則會(huì)造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。）問題11：雙熒光素酶的最終數(shù)值怎么處理？通常比較雙熒光素酶各組的數(shù)值，是需要對螢火蟲熒光檢測的數(shù)值和海腎熒光進(jìn)行歸一化反應(yīng)，歸一化反應(yīng)的計(jì)算數(shù)值為兩者的比值?？返律铮↘MDBioscience）(/)建立了完善的細(xì)胞培養(yǎng)平臺，能夠提供給客戶多