分子生物學(xué)學(xué)習(xí)資料：answer-ch10

10.1描述真核生物核RNA聚合酶在DEA-Sephadex中的洗脫曲線。當(dāng)1μg/mlα-amanitin存在時，洗脫曲線應(yīng)該會發(fā)生什么變化？答：洗脫曲線如圖10.2所示，其中紅線的三個峰分別表示三個RNA聚合酶（已經(jīng)標(biāo)在圖中）當(dāng)存在1ug/ml的鵝膏蕈堿時，曲線中第一個聚合酶的峰值應(yīng)該不變，而第二個和第三個峰值都會下降，這是由于這三個酶對于鵝膏蕈堿的毒性敏感程度是不一樣的，其敏感程度下圖示，由圖10.7易得此結(jié)論。10.2描述實驗證明聚合酶I定位于細(xì)胞的核仁內(nèi)，并給出實驗結(jié)果。答：分別提取細(xì)胞核核質(zhì)中的提取物以及細(xì)胞核核仁中的提取物，進行洗脫試驗，試驗結(jié)果如下圖所示，其中上圖表示細(xì)胞核核質(zhì)中的提取物的洗脫曲線，下圖上圖表示細(xì)胞核核仁中的提取物的洗脫曲線，由這兩個洗脫曲線可以看出RNA聚合酶I在細(xì)胞核核仁中的含量明顯的高于細(xì)胞核核質(zhì)中的含量，這樣就證明了聚合酶I主要存在于細(xì)胞核核仁中。10.3RNA聚合酶I在低離子濃度的情況下活性最高，而且定位于核仁內(nèi)，這些說明了聚合酶I的可能產(chǎn)物是什么？答：這證明RNA聚合酶I主要合成大分子質(zhì)量的rRNA前提物質(zhì)，例如在脊椎動物中主要就是合成45S的RNA，從而作為合成成熟的5.8S,18S,和28SRNA的前提物質(zhì)。10.4我們?nèi)绾沃繧型聚合酶合成大的rRNA前體，II型聚合酶合成mRNA前體？描述一個簡單的體外轉(zhuǎn)錄實驗，以及書中所述實驗。答：體外轉(zhuǎn)錄實驗設(shè)計：以放射性同位素標(biāo)記的UTP以及未標(biāo)記的ATP，GTP，CTP為原料，并加入除模板和聚合酶以外的體外轉(zhuǎn)錄所需物質(zhì)，進行體外轉(zhuǎn)錄實驗。第一組中只加入I型RNA聚合酶和rRNA模板，第二組中只加入I型RNA聚合酶和mRNA模板，第三組中只加入II型聚合酶和rRNA模板，第四組中只加入II型聚合酶和mRNA模板。用同位素檢驗?zāi)慕M由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生，即可證明。書中實驗：分別提取動物肝臟的細(xì)胞核基質(zhì)部分和核仁部分，做凝膠層析，分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核基質(zhì)部分中II型聚合酶較集中分布，說明它參與mRNA前體的合成。而在核仁部分中則是I型聚合酶集中分布，說明它們參與rRNA前體的合成。10.5描述實驗證明聚合酶III參與tRNA和5srRNA的合成，并給出實驗結(jié)果。答：1974年，Roeder和他的同事完成了一個驗證聚合酶=3\*ROMANIII生成tRNA和5sRNA的實驗。在這個實驗中，α-蠅蕈素扮演一個很重要的角色，因為α-蠅蕈素對三種聚合酶有著不同的作用，當(dāng)α-蠅蕈素的濃度很低時它會抑制聚合酶II的活性，但不會影響聚合酶I和III的活性，但在一百倍的高濃度情況下，α-蠅蕈素也會抑制聚合酶III的活性。Roeder和他的同事利用α-蠅蕈素的這個特性完成了驗證聚合酶=3\*ROMANIII生成tRNA和5sRNA的實驗，他們在不同α-蠅蕈素濃度的環(huán)境中培養(yǎng)鼠細(xì)胞核，然后電泳轉(zhuǎn)錄出來的RNA，得到這樣一個結(jié)果：在高α-蠅蕈素濃度的情況下，tRNA和5sRNA的precursor的合成被抑制。故而驗證了聚合酶=3\*ROMANIII生成tRNA和5sRNA10.6酵母RNA聚合酶含有多少個亞基？哪些是核心酶的亞基？哪些亞基對于三種核內(nèi)RNA聚合酶是共有的？答：酵母菌RNA聚合酶II有12個亞基，核心部分為Rpb1,Rpb2和Rpb3，它們是聚合酶的“必須”以及“核心”部分。共有的5個亞基為Rpb5,Rpb6,Rpb8,Rpb10和Rpb12，參與一些合成的基本工作。10.7描述如何用表位附加方法(epitopetagging)從酵母細(xì)胞中一步純化RNA聚合酶II。答：抗體(antibodies)具有與相對應(yīng)的抗原(antigen)特異性結(jié)合的能力，這種能力是通過抗體對抗原分子的某些特征（稱為抗原決定子，如氨基酸序列、特定的化學(xué)基團等）的識別來實現(xiàn)的。這種性質(zhì)可以用于蛋白質(zhì)（或其他化學(xué)物質(zhì)）的純化，表位附加即為其中的一種實驗技術(shù)。用表位附加方法從酵母細(xì)胞中一步純化RNA聚合酶II的步驟如下：(1)通過基因工程手段，在編碼RNA聚合酶II的Rpb3亞基的基因上增加一個片段，使得合成的Rpb3亞基表面具備一個可以被某種抗體特異性識別的氨基酸片段作為表位標(biāo)簽(epitopetag)；(2)將此基因轉(zhuǎn)入Rpb3

亞基基因缺陷型（即不能合成Rpb3亞基）的酵母細(xì)胞中，使之得到表達——這時，酵母細(xì)胞所合成的RNA聚合酶II的表面上便帶有了該氨基酸片段表位標(biāo)簽；(3)將細(xì)胞裂解，提取蛋白質(zhì)，加入該種抗體，抗體與表位標(biāo)簽結(jié)合，即發(fā)生免疫共沉降(immuboprecipitation)，而雜蛋白可被洗脫，從而提純了RNA聚合酶II，可供進一步的分析研究?？贵w與表位標(biāo)簽的結(jié)合和免疫共沉降過程如圖10.7所示。圖10.7用表位附加方法(epitopetagging)從酵母細(xì)胞中一步純化RNA聚合酶II示意圖10.8描述實驗證明聚合酶中的最大亞基與DNA發(fā)生相互作用，并給出實驗結(jié)果。答：使用G11抗體（能夠與Rpb1特異性結(jié)合）與DNA競爭，對競爭出來的產(chǎn)物作凝膠電泳。第一條帶是對照組，用不相干的抗體競爭，結(jié)果未能洗脫Rpb1。第二條帶是用G11抗體競爭，得到兩條帶。這兩條色帶在聚合酶單獨電泳中分別為圖示215KD，180KD處，為Rpb1的兩種形式。本試驗說明了Rpb1能與DNA特異性結(jié)合10.9描述一個實驗，證明RNA聚合酶II的第二大亞基含有形成核苷之間的磷酸二酯鍵的催化位點。并給出實驗結(jié)果。答：實驗步驟如下：1)將一種ATP的類似物——ATP的4-苯甲酸--酯與聚合酶II結(jié)合，并用NaBH4使其形成共價鍵。2)加入同位素標(biāo)記的[-32P]UTP，與ATP類似物形成磷酸二酯鍵。3)電泳分離酶的各個亞基。用放射自顯影處理膠，檢測同位素標(biāo)記的亞基。實驗結(jié)果：第二條帶有同位素標(biāo)記，說明第二大亞基與磷酸二酯鍵的形成有關(guān)。所以第二大亞基含有形成核苷之間的磷酸二酯鍵的催化位點。10.10有什么證據(jù)表明，真核生物RNA聚合酶=2\*ROMANII中最大的三個亞基分別與原核生物RNA聚合酶的β’、β、α亞基同源。答：真核生物酵母菌的RNA聚合酶=2\*ROMANII中最大的三個亞基Rpb1、Rpb2、Rpb3都是RNA聚合酶=2\*ROMANII具有活性所必需的。這三個亞基分別與大腸桿菌RNA聚合酶的β’、β、α亞基同源，有如下證據(jù)。從結(jié)構(gòu)上說，酵母菌Rpb1與大腸桿菌β’亞基有許多相似片斷，Rpb2也與大腸桿菌β亞基有許多相似片斷，這些相似結(jié)構(gòu)相似可以在圖1中明顯看到。Rpb3與α亞基的結(jié)構(gòu)相似雖然不明顯，但它們卻具有一段約20個氨基酸長的精確相似區(qū)域，而且Rpb3與α亞基大小一致，在一個聚合酶全酶中都有兩個Rpb3或α亞基單體。圖10.10A酵母菌Rpb1與大腸桿菌β’亞基、Rpb2與β亞基有許多相似片斷，圖中紅色區(qū)域即表示具有相似結(jié)構(gòu)的區(qū)段從功能上說，Rpb1、Rpb2、Rpb3也分別與β’、β、α亞基有相似性。圖10.10B所示的實驗結(jié)果就是Rpb1具有類似于β’亞基的結(jié)合DNA的位點。SeanCarroll與DavidStollar使用DNA的類似物G11與DNA競爭RNA聚合酶=2\*ROMANII上的DNA結(jié)合位點，洗脫不含結(jié)合位點的多肽鏈或蛋白后，進行電泳分離，發(fā)現(xiàn)留下的，即能與G11結(jié)合的組分，就是Rpb1。圖10.10B驗證Rpb1具有DNA結(jié)合位點的實驗。Lane1為RNA聚合酶=2\*ROMANII提取物與非相關(guān)探針；Lane2為RNA聚合酶=2\*ROMANII提取物與DNA類似物G11的混合液；Lane3為RNA聚合酶=2\*ROMANII提取物的染色圖樣。可見，有兩種蛋白能與G11結(jié)合，進一步研究表明，它們是Rpb1的兩種形態(tài)而酵母菌RNA聚合酶=2\*ROMANII的Rpb2與大腸桿菌的β亞基一樣，與磷酸二酯鍵的形成有關(guān)，這可由ATP類似物標(biāo)記實驗說明。具體實驗為：先將ATP-4-甲苯基-γ-酯與RNA聚合酶=123\*ROMAN=1\*ROMANI、II、III分別反應(yīng)，接著用硼氰化鈉（NaBH4）還原，然后用同位素標(biāo)記的[α-32P]UTP與被鉚定的ATP類似物形成磷酸二酯鍵，最后經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)三種聚合酶都是第二大的亞基被標(biāo)記，在RNA聚合酶=2\*ROMANII中就是Rpb2亞基。Rpb2亞基與大腸桿菌的β亞基的相似性通過研究編碼它們的基因也能發(fā)現(xiàn)。雖然酵母菌RNA聚合酶=2\*ROMANII的Rpb3與大腸桿菌的α亞基在形態(tài)上只有少量相似性，但是Rpb3基因變異的菌株RNA聚合酶=2\*ROMANII無法正常組裝，這與α亞基變異的大腸桿菌完全相同。這一現(xiàn)象預(yù)示了Rpb3與α亞基在功能上的類似。綜上所述，不論從結(jié)構(gòu)上還是從功能上，都有理由相信酵母菌的RNA聚合酶=2\*ROMANII中最大的三個亞基Rpb1、Rpb2、Rpb3分別與大腸桿菌RNA聚合酶的β’、β、α亞基具有同源關(guān)系。10.11當(dāng)RPB4的基因被刪去時，RNA聚合酶=2\*ROMANII的結(jié)構(gòu)會發(fā)生什么變化？這種聚合酶的功能有哪些是正常的，哪些是不正常的？舉出證據(jù)說明。答：當(dāng)RPB4的基因被刪去時，RPB7不能錨定到RNA聚合酶=2\*ROMANII上。這種聚合酶可以正常的催化RNA鏈的延伸和終止，但是不能啟始RNA轉(zhuǎn)錄。證據(jù)如下。用正常的RNA聚合酶=2\*ROMANII和RNA聚合酶=2\*ROMANIIΔ4/7分別催化聚胞嘧啶核苷酸,電泳檢測其產(chǎn)物。因為轉(zhuǎn)錄可以隨機的在這些序列中啟始，故它可以顯示排出起始的干擾僅顯示延伸的情況。實驗結(jié)果表明兩個酶的效果一樣。用5’末端有特殊延伸的，且啟動子有缺陷的DNA，它們分別具有不同的終止子，然后用用正常的RNA聚合酶=2\*ROMANII和RNA聚合酶=2\*ROMANIIΔ4/7分別催化轉(zhuǎn)錄，因為RNA可以在這些特殊延伸起始，故可排除起始的干擾僅觀察終止的情況。電泳檢驗結(jié)果表明兩種聚合酶效果一樣。分別用兩種RNA聚合酶去催化一個由正常啟動子的基因，電泳檢測其結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶=2\*ROMANIIΔ4/7無轉(zhuǎn)錄子產(chǎn)生，而正常的RNA聚合酶=2\*ROMANII有。以上實驗結(jié)果可證明結(jié)論。10.12有些聚合酶含有3種不同的RPB1亞基，給出這些亞基的名字，并將他們在SDS中的相對位置表示出來。這些不同形式的亞基有什么區(qū)別？給出得出上述結(jié)論的證據(jù)。ⅡoⅡaⅡb答：這三種不同的亞基是：Ⅱa,Ⅱb,Ⅱo,它們在SDS中的位置如右圖所示從上到下遷移率增加。其中Ⅱa是RPB1基因的最初產(chǎn)物，Ⅱb是Ⅱa在蛋白酶作用下移除C末端的產(chǎn)物，而Ⅱo是ⅡaC末端一些絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化的產(chǎn)物。在功能上而言，亞基Ⅱa構(gòu)成的聚合酶結(jié)合在啟動子上，而由Ⅱo構(gòu)成的聚合酶參與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的伸長。關(guān)于該結(jié)論的證據(jù)如下：對RPB1的測序可知，該基因能夠產(chǎn)生出一個210KD的肽鏈，而Ⅱa亞基正好是210KD。對于Ⅱb氨基酸序列分析可知，它缺乏Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重復(fù)序列，而這種重復(fù)序列在Ⅱa的CTD中?？惯@種CTD的抗體可以和Ⅱa反應(yīng)，卻不能和Ⅱb反應(yīng)，說明Ⅱb缺乏這個C末端。對于Ⅱo亞基，首先它比Ⅱa大，而且被磷酸化，關(guān)于它的證據(jù)為：1、Ⅱa的CTD中有大量的絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸，而這三種氨基酸的羥基極易被磷酸化,在Ⅱo中也發(fā)現(xiàn)了磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸。而且，Ⅱo在脫磷酸酶的作用下脫去磷酸基后可以轉(zhuǎn)化為Ⅱa.10.13Rpb1(RNA聚合酶的亞基1)的羧基末端的結(jié)構(gòu)如何？答：Rpb1和E.coli的β’具有較好的同源性。如圖所示Rpb1上的綠色部分為其羧基末端。且Rpb1羧基較強磷酸化的一個亞基，它是RNA聚合酶對α-amanitin的抗性的關(guān)鍵亞基。圖10.13Rpb1的序列示意圖。紅色部分為它與E.coli的β’同源的序列，綠色部分為它的羧基末端。10.15描繪用電子結(jié)晶學(xué)和X–光結(jié)晶學(xué)研究酵母RNA聚合酶II和延伸聚合體得到的結(jié)果。答：用X-光檢測研究酵母菌聚合酶II：可以看到酶表面有寬25A的通道，它在模型接近中央處大概有90度的轉(zhuǎn)彎。并且該通道在接近它的左端處被該酶的一個柱片斷部分阻斷，并留下兩個較窄的通道。其中一個通道開在接近RNA3’用電子結(jié)晶學(xué)（電子云的密度不同）檢測DNA的延伸聚合體只能得到二維的結(jié)構(gòu)，但通過多角度的觀察，并整合起來，可以得到較為細(xì)致的結(jié)構(gòu)，并且知道該酶的10個基本結(jié)構(gòu)定位于DNA的哪些位置上。此時，穿過酶的通道呈現(xiàn)出一個深的裂縫的形狀，大部分Rpb1在一邊大部分Rpb2在另外一邊。這個裂縫可以看作一組鉗夾夾住DNA，并且致使DNA一定程度上彎曲。此外，在酶的另一邊，可以看到一堵墻狀的結(jié)構(gòu)位于活性位點外部，使DNA解旋。（具體細(xì)節(jié)書上列了好多，主要得到的結(jié)論是老師上課時講的一句話——DNA在RNA達到10bp時解鏈，即起始階段的轉(zhuǎn)錄片斷長度為10bp左右，而在RNA達到20bp時形成D-R復(fù)合結(jié)構(gòu)，可以知道整個bubble的長度為10bp.）通過這兩種觀測的對比以及相互補充，可以很好的看到RNA復(fù)合酶在DNA上的結(jié)構(gòu)，以及該酶與DNA，RNA，及其復(fù)合體的相對位置關(guān)系。我認(rèn)為這是很好的研究結(jié)構(gòu)的方法。10.17哪些類型的基因有TATAbox序列,哪些類型的基因沒有TATAbox序列?答:1)缺少TATABOX的啟動子在下列兩類基因中可以找到：第一類包括了看家基因,這類基因在所有細(xì)胞的基因構(gòu)成中很活躍,因為它們控制了基本的生物化學(xué)路徑,比如核苷的合成.是維持細(xì)胞生命所必需的；第二類包括了發(fā)育控制基因.例如控制果蠅發(fā)育的同源基因,還有在哺乳動物的免疫機制發(fā)育中活躍的基因。2)擁有TATABOX的啟動子在下述基因中可以找到：一般來說,特異性基因(或叫做“奢侈基因”)，這類基因編碼一些只有在特定類型的細(xì)胞中可以找到的蛋白質(zhì)(比如,皮膚細(xì)胞中的角蛋白和紅細(xì)胞中的血色素)。10.18一段第二類基因的轉(zhuǎn)錄從一個鳥嘌呤核苷酸開始,該核苷酸在TATABOX的第一個堿基下游30bp的長度.如果去掉在此鳥嘌呤核苷酸與TATABOX之間的10bp長度的DNA，并將變異的DNA轉(zhuǎn)到細(xì)胞中表達。轉(zhuǎn)錄會從同一個鳥嘌呤核苷酸開始嗎？如果不是，會從哪里開始？答：不會從同一起點開始。下圖為第二類基因的TATABOX和起始點的位置示意圖。下圖為一個探索TATABOX對轉(zhuǎn)錄的作用的實驗。實驗證明,TATABOX和起始點的間隔長度是一定的，即題中的30bp。因此，刪除鳥嘌呤核苷酸與TATABOX之間的10bp長度的DNA之后，轉(zhuǎn)錄起始點也會下移，即在原來的鳥嘌呤核苷酸下游10bp處。由此可見TATABOX的功能之一是定位轉(zhuǎn)錄起始點。10.19將TATABOX從一個第二類基因的啟動子移走的兩個最有可能的結(jié)果是什么?答：TATAbox在classⅡpromoter中的作用主要為定位轉(zhuǎn)錄的起始點，在一些promoter中也影響轉(zhuǎn)錄活性。所以若將TATAbox移走，1）使得轉(zhuǎn)錄起始隨意化，可從任意點起始；2）對于一些promoter，可能會使轉(zhuǎn)錄活性下降。10.20畫出連接體掃描實驗（linkerscanning）的過程。這個實驗可以提供哪些信息？答：掃描過程如下圖：a)用限制性內(nèi)切酶在要研究的DNA序列中切一段長約10bp的缺口，并使用外部水解酶制造平齊末端；用一段長約10bp的合成的隨機DNA序列(ligatelinker)代替切去的部分b)重復(fù)a的步驟，將由ligatelinker取代的位置向下游移動…c)檢驗經(jīng)過連接體取代的DNA序列的轉(zhuǎn)錄效果。 通過連接體掃描實驗，可以判斷出對啟動子中對轉(zhuǎn)錄起重要作用的區(qū)段（以10bp為單位）10.21列出II類啟動子的兩種常見的上游元件答：常見的II類啟動子上游元件如下：1）GC盒很多II類聚合酶啟動子中都含有GC盒。它們經(jīng)常處在TATA盒的上游，常以2~6或更多的重復(fù)的形式出現(xiàn)。在這些基因中，GC盒的存在對轉(zhuǎn)錄效率起著重要的作用?；騽h除實驗表明，刪除1個GC盒會對轉(zhuǎn)錄效率造成一定的影響，而刪除2個則會大大地降低轉(zhuǎn)錄效率。將GC盒歸入啟動子元件的一個重要原因是它們發(fā)揮作用的能力與其位置有著重要的聯(lián)系。一些特異性轉(zhuǎn)錄因子可以識別GC盒并與之相互作用。2）CAT盒又稱“CCAAT盒”。與GC盒類似，CAT盒有自己的特異性轉(zhuǎn)錄因子（CTF）。不同的基因轉(zhuǎn)錄效率對CAT盒的依賴程度是不同的。10.22畫出一個標(biāo)準(zhǔn)的I類啟動子答：如下圖： 標(biāo)準(zhǔn)的I類啟動子包括兩個元件：核心元件（Coreelement）：在圖中以藍色標(biāo)出，位于轉(zhuǎn)錄起始點處，覆蓋了-45~+20的區(qū)段。上游調(diào)控元件（UCE）：在圖中以黃色標(biāo)出，覆蓋了轉(zhuǎn)錄起始點上游的-156~-107的區(qū)域。10.23I類啟動子是怎樣被發(fā)現(xiàn)的？試給出實驗結(jié)果。答：應(yīng)用連接體掃描實驗（linkerscanning）可以檢測出I類啟動子的兩個重要元件.下圖給出該實驗的結(jié)果：其中紅色條的高度表示相應(yīng)位置上的堿基被突變掉后轉(zhuǎn)錄的相對強度，其中100為野生型（wildtype）啟動子的相對轉(zhuǎn)錄強度。由此可以看出，突變后對轉(zhuǎn)錄效率有明顯影響的有兩個區(qū)段，分別處在-156~-107及-45~+20的位置。由此確定出I類啟動子的兩個相應(yīng)得重要元件（UCE和coreelement）10.24描述并給出表明I類啟動子兩元件間距對轉(zhuǎn)錄效率的影響的實驗，并給出實驗結(jié)果。答：Tjian及合作者以人類的rRNA作為實驗材料研究I類啟動子兩元件間距對轉(zhuǎn)錄效率的影響。他們保持兩元件的內(nèi)部序列不變，而增加或刪減元件間區(qū)段的長度，檢驗做這樣的修改后的啟動子的轉(zhuǎn)錄效率。該實驗結(jié)果由下圖給出：其中黃色和藍色分別表示UCE和coreelement。變異后的啟動子轉(zhuǎn)錄強度由右側(cè)一列數(shù)字給出?？梢钥闯?，刪除4個堿基對轉(zhuǎn)錄強度沒有明顯影響，而刪除16和32個堿基時，轉(zhuǎn)錄效率降為40%~20%；進一步，當(dāng)刪除掉44和53個堿基時，效率減小到了10%；刪除掉64個堿基時，效率就小于5%了。 另一方面，28個堿基仍未對轉(zhuǎn)錄效率造成明顯影響，而當(dāng)增加49個堿基時，效率降為30%。 同時也可以看出，如果改變UCE內(nèi)部堿基，即使兩區(qū)段的距離保持不變，也會對轉(zhuǎn)錄效率造成嚴(yán)重影響。 綜上，可知，I類啟動子的兩個元件的間距對轉(zhuǎn)錄強度起著重要的作用。而且減小間距似乎對轉(zhuǎn)錄效率影響更大。10.25比較經(jīng)典與非經(jīng)典(c