薄層色譜法實驗

薄層色譜法實驗1參考文獻ChP-2020版通則0502薄層色譜法定義：薄層色譜法系將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標準物質(zhì)按同法所得的色譜圖對比。2準備工作2.1儀器與材料2.1.1薄層板2.1.1.1分類固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常用的有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254。在保證色譜質(zhì)量的前提下，可對薄層板進行特別處理和化學改性以適應(yīng)分離的要求，可用實驗室自制的薄層板。圖2-1-1-1薄層板分類2.1.1.2薄層板要求1）固定相顆粒大小一般要求粒徑為10~40μm。2）玻板應(yīng)光滑、平整，洗凈后不附水珠。圖2-1-2-1薄層硅膠板2.1.2點樣器一般釆用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器材。圖2-2-1全自動點樣儀2.1.3展開容器上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時須能密閉。水平展開用專用的水平展開槽。圖2-1-3-1高硼硅玻璃層析缸（左側(cè)雙槽，右側(cè)單槽）2.1.4顯色裝置1）噴霧顯色應(yīng)使用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；2）浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用；3）蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替。圖2-4-1三角薄層噴瓶2.1.5檢視裝置為裝有可見光、254nm及365nm紫外光光源及相應(yīng)的濾光片的暗箱，可附加攝像設(shè)備供拍攝圖像用。暗箱內(nèi)光源應(yīng)有足夠的光照度。圖2-5-1BiostepDD70薄層色譜成像系統(tǒng)2.1.6薄層色譜掃描儀系指用一定波長的光對薄層板上有吸收的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點，進行掃描，將掃描得到的譜圖和積分數(shù)據(jù)用于物質(zhì)定性或定量的分析儀器。圖2-1-6-1薄層色譜掃描儀2.2溶劑1）使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”；2）溶劑組成采用體積量比（如正丁醇-冰乙酸-水=4：1：1，V/V/V），或者絕對量（如18ml甲苯+2ml甲醇）。3）配制總量應(yīng)足以使薄層板的浸入深度約為5mm。可以事先量取展開缸的底座面積×0.5mm得到最少需要的溶劑體積參考值。4）展開劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用，如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。2.2.1溶劑2.2.1.1溶劑的選擇考慮分離成分的極性、溶解度、吸附度。先加入極性較小的溶劑，若不容再加入少量極性大的溶劑一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶?；旌先軇┩ǔＪ褂靡粋€高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑。查閱文獻，目標化合物適用于什么樣的展開劑，可用文獻條件作為初始條件測試，根據(jù)實際情況進行調(diào)整展開劑的配比，直到找到一個分離效果好的展開劑。一般把兩種溶劑混合時，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象，再調(diào)整比例（或者加入第三種溶劑），達到最佳效果；如果沒有分開的跡象（斑點較“拖”），最好是換溶劑。2.2.1.2溶劑極性參數(shù)表名稱介電常數(shù)極性環(huán)已烷2-0.2正已烷1.90.0甲苯2.42.4二甲苯2.42.5苯2.32.7二氯甲烷9.13.1異丙醇18.33.91）一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離；2）中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離；3）強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。2.2.2展開劑2.2.2.1展開劑的選擇對的所需成分有良好的溶解性；可使成分間分開（分離度好）；待測組分的Rf在0.2~0.8之間，定量測定在0.3～0.5之間；與待測組分或吸附劑不發(fā)生化學反應(yīng)；沸點適中，黏度較?。徽归_后組分斑點圓且集中；混合溶劑最好用新鮮配制。物質(zhì)分子化學結(jié)構(gòu)中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。以下分開討論不同化合物極性情況及其對應(yīng)的展開劑。

3操作方法3.1薄層板制備3.2點樣除另有規(guī)定外，在潔凈干燥的環(huán)境中，用專用毛細管或配合相應(yīng)的半自動、自動點樣器械點樣于薄層板上。接觸點樣時注意勿損傷薄層表面。可用專用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣。點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不干擾為宜。圖3-2-1點樣要求3.3展開將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑，密閉。溶劑前沿達到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測。展開前如需要溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持15~30分鐘。溶劑蒸氣預(yù)平衡后，應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則須在展開缸的內(nèi)壁貼與展開缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開劑中，密閉一定時間，使溶劑蒸氣達到飽和再如法展開。必要時，可進行二次展開或雙向展開，進行第二次展開前，應(yīng)使薄層板殘留的展開劑完全揮干。圖3-3-1展開要求3.4顯色與檢視3.5記錄薄層色譜圖像一般可采用攝像設(shè)備拍攝，以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層色譜掃描儀掃描或其他適宜的方式記錄相應(yīng)的色譜圖。4系統(tǒng)適用性試驗按各品種項下要求對實驗條件進行系統(tǒng)適用性試驗，即用供試品和標準物質(zhì)對實驗條件進行試驗和調(diào)整，應(yīng)符合規(guī)定的要求。4.1比移值（Rf）系指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值。除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢查時，各雜質(zhì)斑點的比移值Rf以在0.2~0.8之間為宜。圖4-4-1展開要求RfL1：從基線至展開劑前沿的距離；L2：從基線至展開斑點中心的距離。4.2檢出限系指限量檢查或雜質(zhì)檢查時，供試品溶液中被測物質(zhì)能被檢出的最低濃度或量。一般采用已知濃度的供試品溶液或?qū)φ諛藴嗜芤?，與稀釋若干倍的自身對照標準溶液在規(guī)定的色譜條件下，在同一薄層板上點樣、展開、檢視，后者顯清晰可辨斑點的濃度或量作為檢出限。4.3分離度（或稱分離效能）鑒別時，供試品與標準物質(zhì)色譜中的斑點均應(yīng)清晰分離。當薄層色譜掃描法用于限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度(R)的計算公式為：R=2(d2-d1)/(W1+W2)式中：d2：為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離；d1：為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離；W1及W2：為相鄰兩峰各自的峰寬。除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.0。在化學藥品雜質(zhì)檢查的方法選擇時，可將雜質(zhì)對照品用供試品自身稀釋的對照溶液溶解制成混合對照溶液，也可將雜質(zhì)對照品用待測組分的對照品溶液溶解制成混合對照標準溶液，還可釆用供試品以適當?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液，上述溶液點樣展開后的色譜圖中，應(yīng)顯示清晰分離的斑點。4.4相對標準偏差薄層掃描含量測定時，1）同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)≤5.0%；2）需顯色后測定的或者異板的相對標準偏差應(yīng)≤10.0%。5測定法5.1鑒別按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，在同一薄層板上點樣、展開與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點的位置和顏色（或熒光）應(yīng)與標準物質(zhì)色譜圖的斑點一致。必要時化學藥品可采用供試品溶液與標準溶液混合點樣、展開，與標準物質(zhì)相應(yīng)斑點應(yīng)為單一、緊密斑點。5.2限量檢查與雜質(zhì)檢查按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，并按規(guī)定的色譜條件點樣、展開和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點與相應(yīng)的標準物質(zhì)斑點比較，顏色（或熒光）不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，測定峰面積值，供試品色譜圖中相應(yīng)斑點的峰面積值不得大于標準物質(zhì)的峰面積值。含量限度檢查應(yīng)按規(guī)定測定限量?；瘜W藥品雜質(zhì)檢查可釆用雜質(zhì)對照法、供試品溶液的自身稀釋對照法或兩法并用。供試品溶液除主斑點外的其他斑點與相應(yīng)的雜質(zhì)對照標準溶液或系列濃度雜質(zhì)對照標準溶液的相應(yīng)主斑點比較，不得更深，或與供試品溶液自身稀釋對照溶液或系列濃度自身稀釋對照溶液的相應(yīng)主斑點比較，不得更深。通常應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點數(shù)和單一雜質(zhì)量，當釆用系列自身稀釋對照溶液時，也可規(guī)定估計的雜質(zhì)總量。5.3含量測定照薄層色譜掃描法，按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，并按規(guī)定的色譜條件點樣、展開、掃描測定。或?qū)⒋郎y色譜斑點刮下經(jīng)洗脫后，再用適宜的方法測定。6薄層色譜掃描法系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數(shù)據(jù)用于鑒別、檢查或含量測定。可根據(jù)不同薄層色譜掃描儀的結(jié)構(gòu)特點，按照規(guī)定方式掃描測定，一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。除另有規(guī)定外，含量測定應(yīng)使用市售薄層板。掃描方法可采用單波長掃描或雙波長掃描。如采用雙波長掃描，應(yīng)選用待測斑點無吸收或最小吸收的波長為參比波長，供試品色譜圖中待測斑點的比移值（Rf值）、光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜最大吸收和最小吸收應(yīng)與對照標準溶液相符，以保證測定結(jié)果的準確性。薄層色譜掃描定量測定應(yīng)保證供試品斑點的量在線性范圍內(nèi)，必要時可適當調(diào)整供試品溶液的點樣量，供試品與標準物質(zhì)同板點樣、展開、掃描、測定和計算。薄層色譜掃描用于含量測定時，通常采用線性回歸二點法計算，如線性范圍很窄時，可用多點法校