備課素材：核酸分子雜交 第一學(xué)期高中生物學(xué)選擇性必修三

核酸分子雜交核酸分子雜交是指兩條具有互補序列的核酸單鏈在一定條件下按堿基配對的原則形成雙鏈的過程，雜交后形成的異源雙鏈分子稱為雜交分子或雜交雙鏈，雜交的雙方是探針與待檢測序列。利用DNA變性與復(fù)性的基本性質(zhì)，分子雜交技術(shù)結(jié)合印跡技術(shù)和探針技術(shù)，目的是為了進行DNA/RNA定性或定量的分析。一、印跡技術(shù)在雜交反應(yīng)前，常需要采用瓊脂糖等凝膠將不同分子量的核酸分離，然后進行雜交反應(yīng)。但是凝膠易碎，不便操作，難以直接在凝膠上完成后續(xù)的雜交反應(yīng)。（就是先跑瓊脂糖凝膠電泳，將不同分子量的核酸進行區(qū)分；但是由于凝膠易碎，不能在凝膠上直接進行后續(xù)的雜交反應(yīng)）1975年，E.Southern將瓊脂糖電泳分離的DNA片段在膠中進行變性（用了一些引起DNA變性的化學(xué)試劑），然后將一張硝酸纖維素（NC）膜放在膠上，膜上放上吸水紙巾，利用毛細作用使膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上，使之成為固相化分子。（這里可能就是在膠上先加DNA變性試劑，蓋上一層NC膜，在膜上再放一個吸水紙，水可通過NC膜被吸到吸水紙上，水分子被轉(zhuǎn)移的同時，把DNA片段粘附在了NC膜上）載有DNA單鏈分子的NC膜就可以在雜交液中與另一種DNA/RNA分子（稱為探針，可用同位素標記）進行雜交。具有互補序列的RNA或DNA探針結(jié)合到NC膜的DNA片段上，經(jīng)過放射自顯影或其他檢測技術(shù)就可以顯現(xiàn)雜交分子的有無和其位置。常用的轉(zhuǎn)印方法主要有：毛細管虹吸轉(zhuǎn)移法；電轉(zhuǎn)移法；真空轉(zhuǎn)移法1.毛細管虹吸轉(zhuǎn)移法原理：容器中含有高濃度的NaCl和枸櫞酸鈉的轉(zhuǎn)移緩沖液，上層吸水紙通過虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、NC膜向上運動，帶動凝膠中的DNA片段垂直向上轉(zhuǎn)移到膜上。毛細管虹吸轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移效率不高，尤其對分子量較大的DNA片段。但由于器械簡單，轉(zhuǎn)移效率對Southern雜交已足夠，一直被使用。2.電泳轉(zhuǎn)移法此方法是通過電泳原理將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到膜上。原理：用有孔海綿和有機玻璃板將濾膜與凝膠夾貼在一起，放到盛有緩沖液的電泳槽中，凝膠平面與電場方向垂直，附有濾膜的一面朝向正極（為啥？）。在電場作用下，凝膠中的DNA片段沿與凝膠垂直的方向泳動，滯留在濾膜上，形成印跡。（轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA片段就叫印跡）電泳轉(zhuǎn)移法適用于大片段DNA，但不宜選用硝酸纖維膜（NC膜）；電泳的緩沖液也不能用高鹽的，避免產(chǎn)生強電流破壞DNA。常用的轉(zhuǎn)移法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)是將膠/膜浸入緩沖液然后加電壓；半干轉(zhuǎn)是用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽，半干轉(zhuǎn)比濕轉(zhuǎn)快。3.真空轉(zhuǎn)移法原理：此方法是以濾膜在下、凝膠在上的方式，利用真空泵將轉(zhuǎn)移液從上層容器中通過凝膠抽到下層真空中，同時帶動核酸分子轉(zhuǎn)移到凝膠下面的硝酸纖維素膜或尼龍膜上。真空轉(zhuǎn)移法可以在轉(zhuǎn)膜的同時進行DNA的變性和中和，一般先用變性液轉(zhuǎn)移15～30分鐘，再換用中和液轉(zhuǎn)移15～30分鐘。真空壓力不要太大，否則凝膠被壓縮，轉(zhuǎn)移效率低；真空儀器密閉性良好，防止漏氣核酸樣品多采用毛細管虹吸轉(zhuǎn)移法，也可采用真空轉(zhuǎn)移；蛋白質(zhì)樣品采用電轉(zhuǎn)移二、探針技術(shù)探針：在核酸分子雜交體系中，雜交的雙方是待測核酸序列和已知核酸序列，已知核酸序列又稱為探針（probe）。探針的功能：（1）帶有可檢測標記（2）探針需要事先設(shè)計且已知序列，通過與轉(zhuǎn)移膜上的核酸雜交，獲得或判斷代檢測核酸樣品的相關(guān)信息。探針的種類：（1）cDNA探針(complementaryDNA）通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過擴增重組質(zhì)粒使cDNA得到大量擴增。提取質(zhì)粒后，用限制酶消化重組質(zhì)粒，將cDNA片段切割下來，分離純化，即可作為探針使用。（目前cDNA探針應(yīng)用最廣泛）（2）基因組DNA探針從基因組文庫中篩選獲得一個特定基因的克隆，大量擴增、純化，切取插入片段，分離純化，即可作為探針使用。（3）寡核苷酸序列根據(jù)已知的核酸序列，人工合成一定長度的寡核苷酸片段作為探針。（4）RNA探針采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法得到RNA作為探針。探針的標記（1）放射性標記（高特異性，半