白紋伊蚊湛江種群對(duì)溴氰菊酯的抗藥性及酶活力分析

白紋伊蚊湛江種群對(duì)溴氰菊酯的抗藥性及酶活力分析

白臉蚊是中國(guó)的主要傳播手段，白臉蚊是中國(guó)的主要傳播手段。廣東地區(qū)是登革熱暴發(fā)流行的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū),且登革熱主要由白紋伊蚊傳播。近10年來(lái),隨著全球變暖加劇,人口持續(xù)增長(zhǎng),國(guó)際間的旅行、勞務(wù)和貿(mào)易往來(lái)更加頻繁,登革熱在全世界的發(fā)病率升高了近30倍,已成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。湛江市位于廣東省南部,上世紀(jì)80年代初期和中期曾經(jīng)發(fā)生過(guò)2次登革熱的大暴發(fā)。2007年9-11月,發(fā)生登革熱的本地暴發(fā)流行,報(bào)告本地感染205例。為了預(yù)防控制登革熱的暴發(fā)流行,該地區(qū)加強(qiáng)了媒介蚊蟲的監(jiān)測(cè)與控制力度,同時(shí)也增加了殺蟲劑對(duì)媒介伊蚊的選擇壓力。目前,因登革熱預(yù)防控制尚無(wú)有效疫苗,其防治主要依賴于媒介蚊蟲的預(yù)防控制。長(zhǎng)期以來(lái),我國(guó)在登革熱疫區(qū)的媒介蚊蟲控制中,以化學(xué)防治成蚊為主[粵衛(wèi)(2007)31號(hào)文件]。由于頻繁和大量使用化學(xué)殺蟲劑,我國(guó)有多個(gè)地區(qū)已出現(xiàn)白紋伊蚊對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道,蔡松武等、李成玲等對(duì)廣東省廣州、汕頭、深圳、韶關(guān)市等進(jìn)行白紋伊蚊抗藥性調(diào)查,結(jié)果顯示,該蚊對(duì)高效氯氰菊酯、溴氰菊酯已經(jīng)產(chǎn)生抗性。代謝酶活力增加,是很多昆蟲對(duì)常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制之一,針對(duì)蚊蟲抗藥性與代謝酶活力的關(guān)系研究,也有一些報(bào)道。然而,我國(guó)白紋伊蚊的抗藥性機(jī)制研究較少,為保護(hù)衛(wèi)生殺蟲劑資源,研究抗藥性治理策略,探索白紋伊蚊的抗性機(jī)制,我們于2012年在廣東省湛江地區(qū)采集白紋伊蚊,測(cè)定了其成蚊對(duì)溴氰菊酯的抗藥性水平,并探討了該種群代謝酶的活性及其變化特征。1材料和方法1.1測(cè)定抗藥性用文品92.5%溴氰菊酯原藥,為本實(shí)驗(yàn)室提供的全國(guó)重要病媒生物抗藥性監(jiān)測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)定用藥膜根據(jù)1979年劉維德介紹的WHO方法制作。測(cè)定藥膜濃度參照靳建超方法確定。1.2化學(xué)試劑與儀器多功能氧化酶(MFO)測(cè)定:TMBZ(amresco,313.3)、30%H2O2、細(xì)胞色素C(cytc)(牛心,genta);非特異性酯酶(NSE)測(cè)定:α-乙酸萘酯(α-NA)、α-乙酸萘酚(sigma)、固藍(lán)B鹽(fastblueBsalt)(Fluka產(chǎn)品);谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)測(cè)定:1-氯-2,4二硝基苯(CDNB)、還原型谷胱甘肽(GSH)(sigma進(jìn)口分裝);磷酸緩沖液(PBS)均為0.05mol/LpH7.2,由購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司powdered配制而成;其他化學(xué)試劑均為分析純。成蚊接觸筒(馬來(lái)西亞WHO合作中心);酶標(biāo)儀(Infinite200-PRO);5~50μl排槍(RAININXLS)和300μl排槍(eppendorf);96孔微量滴定板(costar3590);電動(dòng)組織研磨器(天根ose-Y10)等。1.3測(cè)試蟲1.3.1伊蚊實(shí)驗(yàn)室品系引自江蘇省疾病預(yù)防控制中心(CDC)的白紋伊蚊實(shí)驗(yàn)室品系,在未接觸任何殺蟲劑的情況下飼養(yǎng)多年。蚊蟲飼養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,相對(duì)濕度(75±5)%,光照14H∶10D。1.3.2野外種群多樣性廣東省CDC提供,于2012年8月采自廣東省湛江市霞山區(qū)(21°11′53.22″N,110°24′33.23″E)的野外種群。其孳生環(huán)境為居民區(qū)外環(huán)境廢棄的小盆罐積水。在本實(shí)驗(yàn)室上述飼養(yǎng)條件下,飼養(yǎng)至第2代進(jìn)行成蚊生物及生化測(cè)定。1.4蚊的確定及飼養(yǎng)成蚊對(duì)溴氰菊酯的敏感性測(cè)定采用WHO推薦的接觸筒法。將0.02%溴氰菊酯藥膜固定于接觸筒中,將20只3~5日齡雌成蚊放于恢復(fù)筒中,剔除不健康試蟲后,轉(zhuǎn)移至接觸筒,并水平放置接觸1h,再轉(zhuǎn)移至恢復(fù)筒中,于人工氣候培養(yǎng)箱飼養(yǎng)(溫度26℃,相對(duì)濕度75%,光周期14L∶10D),24h后記錄死亡數(shù)。因白紋伊蚊接觸溴氰菊酯藥膜24h后,蚊蟲的活態(tài)與死態(tài)分明,將身體不動(dòng)者判定為死亡。1.5代謝酶的生物化學(xué)參照Polson等、Brogdon和Barber的方法,利用酶標(biāo)儀對(duì)MFO、NSE和GST進(jìn)行測(cè)定。1.5.1min致死在養(yǎng)蚊籠中,用塑料吸蚊管取3~5日齡約30只雌成蚊,于-80℃冰箱凍存5~10min致死。在冰盤上取單只蚊蟲于1.5ml離心管中,加入0.1mlPBS緩沖液,用電動(dòng)組織研磨器勻漿約20s后,補(bǔ)加0.4mlPBS緩沖液后,4℃條件下15000×g,離心15min,取上清液作酶源。1.5.2醋酸鈉緩沖液s1向酶標(biāo)板中分別加入100μl酶液、200μlTMBZ溶液(2mgTMBS∶1ml甲醇∶5ml0.25mol/LpH5.0的醋酸鈉緩沖液),25μl3%H2O2。室溫反應(yīng)5min,測(cè)定A650。用標(biāo)準(zhǔn)品獲得細(xì)胞色素c標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)方程求得酶反應(yīng)體系中細(xì)胞色素c的含量,酶活力單位用“nmolcytc/mgpr”表示。1.5.3酶活的總酚含量的測(cè)定向酶標(biāo)板中分別加入100μl酶液、100μlα-乙酸萘酯溶液(14mgα-乙酸萘酯∶5ml丙酮∶20mlPBS緩沖液),室溫下反應(yīng)15min,加入100μl濃度為1mg/ml固藍(lán)溶液(PBS)終止反應(yīng),再放置4min后,測(cè)定A620。用α-乙酸萘酚標(biāo)準(zhǔn)品獲得其標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)方程求解酶反應(yīng)體系中生成的α-乙酸萘酚量。酶活力單位用“nmolα-乙酸萘酯/(min·mgpr)”表示。1.5.4有關(guān)“s”b3取100μl酶液分別加入酶標(biāo)板各孔中,同時(shí)加入100μl濃度為0.61mg/mlGSH溶液(PBS)和100μlCDNB溶液(2mgCDNB∶1ml丙酮∶9mlPBS緩沖液),即刻測(cè)定A340,室溫放置10min后再次測(cè)定A340。用CDNB的消光系數(shù)extinctioncoefficient(e=9.6mmol/L)將A值轉(zhuǎn)化成酶比活力[nmol/(min·mgpr)]。1.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析1.6.1酶活性計(jì)算式中,cytc表示細(xì)胞色素c,pr表示每只測(cè)定蚊蟲的酶液制備后樣品的酶液濃度。1.6.2w、gst酶活力測(cè)定用SPSS20.0軟件對(duì)資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)(Kolmogorov-Smirnov),再進(jìn)行WilcoxomW檢驗(yàn),不同種群間MFO、NSE、GST酶活力差異分析,以及同一種群內(nèi)3種代謝酶活力與蛋白質(zhì)濃度的相關(guān)性檢驗(yàn)(正態(tài)分布資料使用Pearson檢驗(yàn),非正態(tài)資料使用Spearman)。所有圖表制作都使用SPSS20.0軟件。2結(jié)果2.1zj種群成蚊用0.02%的溴氰菊酯為診斷劑量,參考WHO對(duì)按蚊抗性的判斷標(biāo)準(zhǔn),ZJ種群成蚊已經(jīng)產(chǎn)生高抗。而與之相比,LAB對(duì)溴氰菊酯處于敏感水平,死亡率為98.46%,二者的死亡率差異較大,接近80%(表1),因此可以作為抗藥性代謝酶研究的參考品系。2.2對(duì)溴氰菊酯mfo、nse、gst的活性ZJ種群成蚊的MFO、NSE、GST活性分別為(1.97±1.16)nmolcytc/mgpr、(35.91±22.48)nmolα-乙酸萘酯/(min·mgpr)和(17.91±8.05)nmol/(min·mgpr),與LAB相比都有顯著升高,分別是LAB的1.67、1.91和1.96倍(表2),經(jīng)WilcoxomW檢驗(yàn),2個(gè)種群的MFO、NSE、GST酶活力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。可見(jiàn),ZJ種群對(duì)溴氰菊酯的抗藥性產(chǎn)生過(guò)程中,代謝酶起到一定作用。對(duì)于MFO、GST和NSE酶活力,ZJ種群的種內(nèi)差均>LAB,ZJ種群的GST酶活力均值水平幾乎為L(zhǎng)AB的2倍,ZJ種群的NSE種內(nèi)差異約為L(zhǎng)AB的5倍。表明NSE和GST在廣東省ZJ種群的白紋伊蚊中已經(jīng)有很大變化,如果存在持續(xù)的殺蟲劑選擇壓力,這種差異會(huì)在種群中更加明顯地表現(xiàn)出來(lái)。而MFO在2個(gè)種群中相對(duì)比較集中?？梢?jiàn),在湛江野外種群中,抗藥性的產(chǎn)生MFO的變化不大(圖1)。2.3zj和la的gst活力差異ZJ種群的MFO活力呈正偏態(tài)分布,與LAB相比酶活力變化范圍較大;LAB白紋伊蚊基本呈正態(tài)分布。ZJ種群的NSE活力呈現(xiàn)正偏態(tài)分布,LAB則呈正態(tài)分布(圖2)。圖2顯示,ZJ種群GST活力呈現(xiàn)正偏態(tài)分布,但是偏度極小,僅為0.2,可能該酶活力的變化處于相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)期;LAB的GST活力呈正態(tài)分布?？傊?湛江白紋伊蚊的3種代謝酶均呈現(xiàn)正偏態(tài)分布,一定程度上說(shuō)明它們均處于上升階段,即該種群處于抗性發(fā)展過(guò)程中。2.4zj種群的遺傳多樣性與酶活力白紋伊蚊ZJ種群和LAB的3種代謝酶活力與蚊蟲個(gè)體的蛋白質(zhì)含量(每只蚊蟲500μl勻漿后的濃度),用Pearson(正態(tài)數(shù)據(jù)資料)或Spearman(非正態(tài)數(shù)據(jù)資料)進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn),結(jié)果表明二者間存在極顯著的負(fù)相關(guān)性(P<0.01),ZJ種群的相關(guān)系數(shù)(r)=-0.77,LABr=-0.73(圖3A)。而ZJ種群和LAB的NSE、GST與個(gè)體的蛋白質(zhì)含量間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)(圖3B、C)。用LAB的酶活力均值和方差(ue0af±1.96s),計(jì)算3種代謝酶活力的95%參考范圍,結(jié)果MFO為0.12~2.54nmolcytc/mgpr,NSE為10.66~28.37nmolα-乙酸萘酯/(min·mgpr),GST為3.63~16.06nmol/(min·mgpr)。以各上限值為抗性個(gè)體判斷指標(biāo),評(píng)估種群中的抗性個(gè)體百分率。由表3可見(jiàn),ZJ種群白紋伊蚊成蚊對(duì)MFO、NSE和GST單一酶種產(chǎn)生抗性的個(gè)體分別占27.91%、59.76%和72.73%;對(duì)NSE和GST、MFO和GST以及MFO和NSE同時(shí)產(chǎn)生抗性的個(gè)體分別占44.16%、24.68%和18.29%;已有15.58%的個(gè)體對(duì)3種代謝酶都產(chǎn)生抗性。3抗藥性菌株活性ZJ種群白紋伊蚊成蚊與實(shí)驗(yàn)室敏感種群成蚊相比個(gè)體較小,同時(shí)試驗(yàn)中對(duì)樣品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定也發(fā)現(xiàn),LAB種群雌成蚊的蛋白質(zhì)含量是ZJ種群的1.5倍。本研究結(jié)果顯示,ZJ種群蚊蟲的MFO、NSE和EST的酶活力與敏感品系相比分別是1.67、1.91和1.96倍,且MFO酶活力與蚊蟲的蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān),而NSE、GST的酶活力與蚊蟲蛋白質(zhì)含量無(wú)關(guān),表明ZJ種群蚊蟲MFO的酶活力與蚊蟲個(gè)體大小有關(guān),而NSE、GST的酶活力與蚊蟲個(gè)體大小無(wú)關(guān)。在白紋伊蚊的ZJ種群中,NSE和GST的酶活力升高可能是其對(duì)溴氰菊酯產(chǎn)生高抗的主要機(jī)制。吳家紅等針對(duì)白紋伊蚊實(shí)驗(yàn)室溴氰菊酯抗性品系的幼蟲研究,發(fā)現(xiàn)盡管其生物測(cè)定的抗藥倍數(shù)已經(jīng)高達(dá)480倍,但是其GST和NSE活性與敏感品系相比僅略有升高,分別是1.29倍和1.12倍。而用PBO抑制后對(duì)幼蟲增效顯著,顯示出MFO是主要抗藥性機(jī)制。而本研究是針對(duì)具有高抗水平的白紋伊蚊野外種群成蚊代謝酶進(jìn)行的研究,且其MFO的活力增加僅為實(shí)驗(yàn)室敏感品系的1.67倍。可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)室選育的溴氰菊酯抗藥性品系與野外對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制不同。導(dǎo)致兩個(gè)種群產(chǎn)生如此巨大差異的原因,有待進(jìn)一步研究。ZJ種群內(nèi)的個(gè)體差異較大,可見(jiàn)該種群的抗性處于快速變化階段,還未呈現(xiàn)穩(wěn)定態(tài)勢(shì)。一方面說(shuō)明這是抗藥性快速上升的階段,另一方面也可以利用這個(gè)時(shí)期種群內(nèi)抗藥性的不穩(wěn)定性及時(shí)進(jìn)行抗藥性治理。溴氰菊酯是一種廣譜、高效殺蟲劑,也廣泛應(yīng)