化學生物學專業(yè)開題報告范例

PAGEPAGE6四川農(nóng)業(yè)大學本科生畢業(yè)論文（設計）開題報告畢業(yè)論文（設計）題目β葡萄糖苷酶的篩選及其酶學性質(zhì)和動力學的研究選題類型應用基礎型課題來源自選項目學院生命科學與理學院專業(yè)化學生物學指導教師黃乾明職稱教授姓名馮沁年級2008級學號200858261立題依據(jù)近年來，β-葡萄糖苷酶（以下簡稱簡稱BGL）作為風味酶的一種，其應用也逐漸得到開發(fā)。茶葉、水果中的風味前體物多以糖苷（單帖烯基-β-D-葡萄糖苷）的形式存在，BGL與其它風味酶協(xié)同作用于該前體物釋放出風味成分。將其應用于（果）酒、茶葉、果汁中可起到增香作用。如李平等人研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉β-D-葡萄糖苷酶對蘋果汁、檸檬汁、茶汁的增香效果良好；而凌建斌研究了BGL對葡萄酒的增香機理。另外，為了提高酶的利用率及使用壽命，人們對不同的酶進行修飾、固定化、或微膠囊化。對BGL固定化技術有許多種，如利用醋酸纖維的纖維包埋法、利用鈉玻璃或鉛玻璃的載體結(jié)合法、利用聚乙烯酸的共價結(jié)合法、利用可溶性載體（葡聚糖）的具有酶衍生作用的固定化等等。Cantarella等人將BGL固定在脫乙酰殼聚糖上，應用于造酒工藝中提高酒的香味。而QuanYi等人對BGL進行微膠囊化，并設計了一個生化反應器來利用β-D-葡萄糖苷酶合成辛基和己基-β-D-Glu-copyranoside,發(fā)現(xiàn)微膠囊化BGL較用XAD-4固定化BGL的反應速高2.5倍，而且反應條件更為溫和。目前，工業(yè)上對BGL的主要應用是生產(chǎn)低聚龍膽糖。低聚龍膽聚是龍膽二糖、三糖、四糖的混和物，生產(chǎn)過程中，將高濃度的葡萄糖液用霉菌生產(chǎn)的BGL在較高溫度下作用，使葡萄糖發(fā)生轉(zhuǎn)移反應和縮合反應來酶法合成低聚龍膽糖。它比麥芽糖漿具有更高的吸水性和較低的粘度，可防止食品中的淀粉老化和保持食品中的水分；不易為人體消化酶所消化，為低熱值低聚糖對雙歧桿菌具有較強的增殖作用；具有輕微的苦味，特別適合于咖啡制品和巧克力制品中應用，具有增味或味覺改良作用。由于其顯著的保健功能，低聚龍膽糖及類似低聚糖類正日益受到消費者的青睞。目前我國低聚糖類的產(chǎn)量仍很小，至于低聚龍膽糖更未見有報導生產(chǎn)。目前世界上生產(chǎn)龍膽低聚糖的唯一公司是NihonShokuhinKako,其商品名為"Gintose",年產(chǎn)量只有300-400噸。β—葡萄糖苷酶葡萄糖苷水解酶，它屬于纖維素酶類。是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶。根據(jù)其底物特異性將其歸類于烴基β—葡萄糖苷酶、纖維二糖酶、或水解烴基-β-糖苷基和寡聚糖的酶類。又據(jù)BGL的基因序列的不同有β-葡萄糖苷酶A和β-葡萄糖苷酶B之分。兩者盡管同屬β-葡萄糖苷酶。但其底物特異性卻不盡相同。BGL在自然界廣泛分布，幾乎在所有的生物體中都有存在，因其來源不同而性質(zhì)各異，在人類的糖原降解和動物、植物、微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。隨著從大量嗜熱性細菌分離出了BGL后，由于其高度的耐熱穩(wěn)定性及高活性而對纖維質(zhì)糖化工業(yè)極為有利，日益受到人們的重視。與美國，日本等國相比，我國的研究工作主要還在生產(chǎn)菌種的篩選方面，關于其性質(zhì)，化學結(jié)構，催化機制等方面的報導幾乎仍是空白。BGL參與生物體的糖代謝，對維持生物體的正常生理功能起著重要作用，它把細菌的BGL在酶解纖維素時就起著至關重要的作用，它把由纖維素酶降解生成的纖維二糖和三糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的葡萄糖。而哺乳動物和人體內(nèi)的乳糖酶/根皮苷(LPH)水解酶也含有一種芳基-β-葡萄苷酶，LPH因其涉及成人型乳糖酶缺乏病一種常見的人體基因紊亂病而被廣泛研究。一直以來，人們認為BGL參與微生物糖代謝的非磷酸途徑，Kengen等人研究發(fā)現(xiàn)，它其實參與的是EMP糖酵解途徑，是參與雙歧桿菌糖代謝的有關酶系之一。BGL的另一主要應用是用于降解纖維素。纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維成葡萄糖的過程細節(jié)和作用機理還不清楚或未有定論。一般認為由內(nèi)切葡聚糖作用于微纖維的非結(jié)晶區(qū)，纖維二糖水解酶再從非還原端依次分解產(chǎn)生纖維二糖和三糖，后者再由BGL水解成葡萄糖。纖維素是葡萄糖以β-1，4-鍵結(jié)合聚合物，為植物細胞壁的構成成分，占植物干重的1/2-1/3。全球一年間由光合作用生產(chǎn)的纖維素達1000億噸，是最豐富的可再生資源。將植物纖維應用于發(fā)酵食品工業(yè)原料，對人類將是一個重大的貢獻，可以使我們擺脫對谷物糧食的絕對依賴，緩和世界資源緊缺。另外，根據(jù)BGL的半乳糖酶活力還可將其應用于乳品工業(yè)來分解乳糖，與其它酶協(xié)同作用生產(chǎn)葡萄糖與單細胞蛋白，以及飼料工業(yè)和醫(yī)藥領域等。2研究的主要內(nèi)容本實驗主要對產(chǎn)BGL菌進行篩選及BGL酶活性的測定。3研究方案3.1技術路線土樣的采集土樣的采集β-葡萄糖苷酶的分離β-葡萄糖苷酶的分離產(chǎn)BGL菌篩選β-葡萄糖苷酶的動力研究測定酶的活性溫度范圍和最適溫度β-葡萄糖苷酶的動力研究測定酶的活性溫度范圍和最適溫度測定酶的活性PH范圍和最適PH3.2實驗材料與儀器3.2.1****************3.2.2主要生化試劑和*****************3.2.3**************3.2.5***************3.2.6*************3.2.73.3實驗方法3.2.1取土樣1g，溶于99ml無菌水，配成10-2懸濁液，再逐步稀釋成10，10，10，10，各吸取1ml于液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，溫度為30℃，時間為3d。然后再分別在PDA培養(yǎng)基上按常規(guī)涂布方法分離培養(yǎng)3d，獲取單菌落。噴涂1mol/L的Na2CO3溶液，挑取有黃色透明圈的單菌落于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3d，以纖維二糖及pNPG為底物測各自β-葡萄糖苷酶活力。選擇酶活高者為研究菌種。3.3.2產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)3d后，加入65ml蒸餾水（與培養(yǎng)前加入的Mandels營養(yǎng)液35ml總體積為100ml，即固液比例約為1：14）于40℃水浴浸提1h，壓濾取濾液，在4℃下于3500r/min冷凍離心20min，取上清粗酶液備用。3.3.3粗酶上樣到預先用檸檬酸-磷酸緩沖液（0.02mol/L，PH5.0）平衡的SephadexG-150柱（2.5×90cm）。收集β-葡萄糖苷酶活力峰，超濾濃縮除鹽后，上樣到相同緩沖液平衡的DEAE-SephadexA-50柱（3.3×30cm），用0～0.4mol/LNaCl線性梯度洗脫（2×500ml）。收集高活力蛋白峰，超濾除鹽后，上樣到想通緩沖液平衡的DEAE-SephadexA-50柱（2.0×30cm），用0～0.3mol/LNaCl梯度洗脫3.3.43.3.4.1標準曲線的制作：分別吸0.1%葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0毫升于試管1、2、3、4、5、6號，用蒸餾水將每支試管加水到1ml，再加1mLDNS試劑，充分混合后在沸水中煮沸5分鐘，冷卻后用蒸餾水稀釋至10ml，用7230分光光度計在波長540nm處測其OD值，以1號試管為對照。取0.5ml一定稀釋度的樣液，加入0.5ml0.5%的水楊苷（溶于0.1MpH=4.8醋酸緩沖液中），55℃保溫20分鐘后，加入1mlDNS試劑，充分混合在沸水中煮沸5分鐘，冷卻后用蒸餾水稀釋至10ml，在7230型分光光度計上于540nm處測OD值，以加熱滅活的酶液按照同樣方法處理作為空白。上述條件下，定義每小時由底物產(chǎn)生1umol還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個酶活單位（u）。3.3.4.2取0.5ml一定稀釋度的樣液，加入0.5ml0.5%的水楊苷（溶于0.1MpH=4.8醋酸緩沖液），55℃保溫5、10、20、25、30、40、50、60分鐘，分別加入1mlDNS試劑，充分混合后在沸水中煮沸5分鐘，迅速冷卻，用蒸餾水稀釋至10ml，在入=540nm處測OD值，作圖。3.最適pH是在不同pH緩沖液(0.1mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液pH2～8,0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液,pH9-1)中測定,以水楊苷為底物;pH穩(wěn)定性的測定是先使酶在上述緩沖液中20℃保溫24h,再測定活力.最適溫度是在pH4.8,0.1mol/L的醋酸緩沖液中測定,溫度范圍4～80℃,溫度穩(wěn)定性測定按文獻[2]測定,先使酶在不同溫度保溫30min，然后按3.在pH4.8,0.1mol/L醋酸緩沖液中,分別用0.3～3mmol/L8個不同濃度水楊苷,纖維二糖,對硝基酚-β-葡萄糖苷為底物。按3.3.4測定酶活力.米氏常數(shù)的測定Lineweaver-Burk作圖法。pH對動力學參數(shù)的影響按3.3.5條件測定,以水楊苷為底物。4預期研究結(jié)果4.1確定β-葡萄糖苷酶活性最佳的最適條件通過研究找出β-葡萄糖苷酶活性最佳的最適pH、溫度。4.2初步探索*****************************。5論文進度安排第一階段：2011.*-2011.*，β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選；第二階段：2011.*-2011.*，β-葡萄糖苷酶的分離；第三階段：2011.*-2011.*，酶活測定；第四階段：2011.*-2011.*，pH和溫度適應性與動力學測定；第五階段：2011.*-2011.*，對本項研究進行討論、分析、評估、整理、撰寫論文。參考文獻[1]楊勝遠，劉玉燕，梁智群。β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的分離篩選。工業(yè)微生物，2002，32（4）：36～38[2]孫迎慶，曹淑貴，韓四平。β-葡萄糖苷酶的分離純化和性質(zhì)研究。中國生物化學與分子生物學報，1998，14（1）：82～86[3]顧衛(wèi)民，郭海風，沈愛光。β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌、發(fā)酵條件的優(yōu)化粗分離及其特性研究。江蘇食品與發(fā)酵，2001，4：12～16指導教師意見指導教師簽名：