阿霉素抑制mcf-7adm細胞耐藥模型的建立

阿霉素抑制mcf-7adm細胞耐藥模型的建立

0mdr的產(chǎn)生機制乳腺癌是女性常見的腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的身心健康。據(jù)統(tǒng)計,世界范圍內(nèi)每年新增患者約200萬人,死亡率呈逐年上升趨勢［１－２］。目前,乳腺癌的治療中,化療占有十分重要的地位,尤其是對于癌細胞已經(jīng)擴散的患者,化療是主要的治療方法。然而隨著化療藥物使用時間的增長,化療藥物對腫瘤細胞的殺死作用逐漸減小,同時也會表現(xiàn)出對不同結(jié)構(gòu)和作用機理的藥物產(chǎn)生交叉耐受性,這種現(xiàn)象稱為多要耐藥性(multidrugresist-ance,MDR)［３］。腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥是化療成功的主要障礙,對腫瘤的治療極為不利,也是困擾著腫瘤學(xué)家和癌癥患者的一個重大問題。MDR發(fā)生機制比較復(fù)雜,但目前ABC轉(zhuǎn)運蛋白(theATP-BindingCassetteTransporters)被認為是導(dǎo)致MDR的主要機制之一,其在腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生中的主要作用是將化療藥物由腫瘤細胞內(nèi)泵至細胞外,降低細胞內(nèi)藥物濃度,從而導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生［４］,其中與臨床腫瘤治療關(guān)系最密切的是AB-CB1、ABCC1、ABCG2。建立耐藥細胞系是研究腫瘤細胞的重要手段,對腫瘤的治療具有十分重要的意義,是探討惡性腫瘤多藥耐藥機制及其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的基礎(chǔ)。本研究采用大劑量間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MCF-7細胞,建立阿霉素耐藥的人乳腺癌MCF-7細胞系,并檢測耐藥模型較親本株的耐藥倍數(shù),細胞內(nèi)藥物的積累量等參數(shù),以及多藥耐藥的標(biāo)志基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的表達變化,為深入研究腫瘤耐藥及多藥耐藥逆轉(zhuǎn)提供理想的模型和實驗依據(jù)。1材料和方法1.1mtt和dmso人乳腺癌MCF-7細胞系購于中國科學(xué)院上海細胞生物所,1640培養(yǎng)液購于康寧公司,胎牛血清購于Thermo公司,0.25%胰酶購于碧云天公司,噻唑藍(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny-ltetrazoliumbromide,MTT)、二甲基亞砜(Dimeth-ylsulfoxide,DMSO)購于sigma公司,阿霉素(Ad-riamycin,ADR)購于生工生物公司。1.2體外細胞u/ml鏈霉素檢測用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)液在37℃,5%CO２飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25%胰蛋白酶消化,3~5d傳代1次,取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。1.3阿霉素對mcf-7/細胞增殖的抑制率及ic采用大劑量間歇誘導(dǎo)MCF-7細胞［５］。1取對數(shù)期生長的MCF-7細胞按8×10３個/孔接種于96孔板,每孔加190μL細胞懸液,培養(yǎng)24h后,加入終濃度為0.02、0.1、0.5、2.5、12.5μg/mL的阿霉素10μL/孔,設(shè)3個復(fù)孔;37℃、5%CO２條件下培養(yǎng)48h;加入5mg/mL的MTT10μL繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄去培養(yǎng)上清,每孔加入DMSO150μL搖床上搖10min,測定各孔的OD５７０值,計算阿霉素對MCF-7/細胞增殖的抑制率及IC５０。其計算公式為:細胞生長抑制率/%=[1-(實驗組OD值-調(diào)零組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)]×100。2取MCF-7細胞接種于6㎝培養(yǎng)皿中,37℃,5%CO２飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),進入對數(shù)生長期后加入終濃度為0.6μg/mL(>IC５０)的阿霉素,作用12h,棄含藥培養(yǎng)液換不含阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)代,待細胞生長狀態(tài)良好以后,按上述方法重復(fù),直至細胞能維持在0.6μg/mL阿霉素濃度下長期培養(yǎng)即成為耐藥人乳腺癌細胞模型MCF-7/Adm。1.4阿霉素對mcf-7/adm細胞增殖的抑制率及實驗指標(biāo)取對數(shù)期生長的MCF-7細胞,調(diào)整細胞密度,按每孔8×10３個細胞接種于96孔板中,每孔加190μL細胞懸液,培養(yǎng)24h后,加入不同濃度的ADR,其終濃度分別為0、1、5、25、125、250μg/mL,每孔總體積200μL;設(shè)對照孔為不加藥物的;調(diào)零孔為不加細胞的培養(yǎng)液,每組設(shè)3個復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃、5%CO２培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h,各孔加入MTT(5mg/mL)10μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄去培養(yǎng)上清,每孔加入DMSO150μL搖床上搖10min,測定各孔OD５７０值,計算阿霉素對MCF-7/Adm細胞增殖的抑制率及IC５０值、耐藥指數(shù)。其計算公式為:耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細胞IC５０/野生型細胞IC５０。1.5阿霉素上流式細胞術(shù)檢測細胞的活性取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期MCF-7細胞、MCF-7/Adm細胞,分別以1×10５個細胞接種于6cm培養(yǎng)皿中,加RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,在培養(yǎng)液中加入阿霉素至終濃度為5μg/mL,培養(yǎng)24h后,0.25%胰蛋白酶消化收集細胞,冷PBS洗滌2次,在重懸于冷PBS中,上流式細胞儀檢測(激發(fā)波長488nm,反射波長575nm)。1.6實時熒光定量pcr檢測取對數(shù)生長期的MCF-7細胞、MCF-7/Adm細胞,分別以1×10５個細胞接種于6㎝培養(yǎng)皿中,加RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72h后,收集細胞。Trizol法提取總RNA,檢測其濃度和純度。經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄分別得到其cDNA,用于Real-timePCR擴增。引物如表1所示,PCR體系的總體積為20μL,其中包括ddH２06.4μL,上下游引物分別0.8μL,已稀釋的cDNA2μL,SYRB10μL,置于實時定量PCR儀設(shè)置反應(yīng)程序并進行PCR反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃10min,95℃15s,60℃1min,40個循環(huán)后收集熒光。采用2－ΔΔＣｔ法分析數(shù)據(jù)。1.6統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析,采用t檢驗、方差分析,資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2結(jié)果2.1mcf-7細胞的形態(tài)變化通過終濃度為0.6μg/mL的阿霉素反復(fù)間歇誘導(dǎo),歷時8個月成功誘導(dǎo)出MCF-7/Adm細胞。凍存復(fù)蘇后細胞仍能穩(wěn)定生長、增殖。如圖1,與野生型MCF-7細胞比較,耐藥細胞株MCF-7/Adm的形態(tài)發(fā)生明顯變化,邊緣不再呈尖角梭型,相對比較圓滑。野生型MCF-7細胞之間接觸比較緊密,而耐藥細胞株MCF-7/Adm之間間隙比較大,排列比較松散。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),耐藥細胞株MCF-7/Adm消化時間較野生型稍長。2.2adm對mcf-7細胞表型的抑制作用不同濃度的ADM作用于MCF-7和MCF-7/Adm細胞48h后,如圖2所示,ADM對MCF-7和MCF-7/Adm細胞的抑制率都隨著ADM濃度的升高而增大,但ADM對MCF-7細胞的抑制作用明顯比MCF-7/Adm的強,0.02μg/mL的ADM已經(jīng)對MCF-7細胞產(chǎn)生抑制作用,但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時,對MCF-7/Adm未見明顯抑制作用。與MCF-7細胞相比,MCF-7/Adm細胞對ADM有明顯的耐藥性(表2),MCF-7/Adm細胞的耐藥指數(shù)RI為324倍(P<0.01)。2.3mcf-7和mcf-7/adm細胞內(nèi)阿霉素的熒光強度用終濃度為5μg/mL的ADM處理MCF-7細胞和MCF-7/Adm細胞24h后,流式細胞術(shù)檢測MCF-7和MCF-7/Adm細胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴姸?結(jié)果如圖3顯示MCF-7細胞內(nèi)ADM的熒光強度明顯比MCF-7/Adm高,分別為98.6%和51.4%。說明MCF-7/Adm細胞內(nèi)的阿霉素蓄積量明顯低于MCF-7細胞,進一步說明MCF-7/Adm細胞較MCF-7細胞對阿霉素產(chǎn)生耐藥性。2.4mcf7-adm細胞的abcg2、abcb1和abcc1基因表達水平藥耐藥的標(biāo)志基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表達Real-timePCR結(jié)果顯示,與敏感細胞株MCF7相比,MCF-7/Adm細胞內(nèi)ABCG2、ABCB1和ABCC1基因的表達有明顯差異,如圖4,ABCG2和ABCC1在耐藥細胞中表達水平下調(diào),而ABCB1在耐藥細胞中表達水平上調(diào)。3阿霉素耐藥乳腺癌細胞的活性目前腫瘤的多藥耐藥性仍被視為化療中的最大障礙。各種腫瘤細胞獲得耐藥性的機制,都可能成為今后化療的靶點［６］。因此,深入研究腫瘤細胞耐藥性機制的產(chǎn)生,尋找關(guān)鍵的靶點,進而針對靶點設(shè)計逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥性的藥物,為降低癌癥死亡率和提高治愈率增加希望［７］。腫瘤耐藥細胞株的建立是研究MDR發(fā)生機制和逆轉(zhuǎn)策略的重要手段?？梢哉f,目前已知的MDR機制幾乎都首先在耐藥細胞株中發(fā)現(xiàn),而后在臨床病人中得到證實的［８］。國內(nèi)外學(xué)者們用藥物遞增誘導(dǎo)法建立了多種耐藥腫瘤細胞株,以深入研究腫瘤耐藥的機制。體外建立耐藥細胞株作為研究腫瘤細胞MDR機制的重要工具至今已有20多年的歷史,已產(chǎn)生多種誘導(dǎo)耐藥,建立耐藥細胞系的方法［５，８－９］。阿霉素(adriamycin,ADM)是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的抗腫瘤藥物,抗瘤譜較廣,主要適用于急性白血病,對急性淋巴細胞白血病及粒細胞白血病、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等都有一定療效［１０］。它是一種蒽環(huán)類抗生素,主要是通過進入細胞核固定在拓撲異構(gòu)酶Ⅱα-DNA復(fù)合體上,影響細胞增值,達到殺傷腫瘤細胞的目的,對各種生長周期的腫瘤細胞都有一定的殺傷作用［１１］。研究表明,腫瘤化療過程中長期使用阿霉素會導(dǎo)致腫瘤細胞對其產(chǎn)生耐藥性,而且已經(jīng)有很多阿霉素耐藥細胞株構(gòu)建成功的例子,所以本課題用阿霉素誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7,建立可靠的腫瘤細胞多藥耐藥性模型。本研究所采用的大劑量間歇誘導(dǎo)法與臨床周期性化療相似,更好地模擬臨床上化療患者出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象,它對腫瘤多藥耐藥性的研究更有意義。經(jīng)過此方法成功誘導(dǎo)得到MCF-7/Adm耐藥株,其耐藥指數(shù)為324。其細胞形態(tài)較野生型MCF-7細胞發(fā)生明顯變化,而且在培養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)耐藥株生長也相對緩慢,胰酶消化時間也較野生型稍長。MTT結(jié)果提示兩株細胞對ADM的敏感性存在著顯著的差異(P<0.01)。0.02μg/mL的ADM已經(jīng)對MCF-7細胞產(chǎn)生抑制作用,但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時,對MCF-7/Adm未見明顯抑制作用,提示MCF-7/Adm細胞對ADM產(chǎn)生了顯著的耐藥性。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示耐藥株內(nèi)阿霉素濃度明顯降低,這進一步說明耐藥細胞株構(gòu)建成功。Real-timePCR結(jié)果顯示耐藥細胞內(nèi)AB-CB1基因表達上調(diào),而ABCC1基因和ABCG2基因表達下調(diào)。初步推斷其產(chǎn)生耐藥性與ABCB1基因表達上調(diào)有關(guān),ABCB1導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥主要是將化療藥物由腫瘤細胞內(nèi)