糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)

糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)

糖尿病性尿失禁（ri）是糖尿病最嚴(yán)重、最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是最常見的盲性疾病之一。創(chuàng)建一個(gè)穩(wěn)定可靠并與人類接近的動(dòng)物模型是研究本病的重要基礎(chǔ)［2］。本研究采用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠,建立視網(wǎng)膜病變模型,并進(jìn)行HE染色和透射電鏡觀察,結(jié)果如下。糖尿病大鼠血糖等情況檢測(cè)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年健康Wistar大鼠(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院提供)80只,雄性,體重200~250g,清潔級(jí)別。2.實(shí)驗(yàn)方法:將所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、糖尿病組1個(gè)月組、糖尿病組3個(gè)月組和糖尿病5個(gè)月組共4個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組20只。將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,禁食水12h后,按60mg/kg腹腔內(nèi)1次注射STZ(STZ溶于新配制的0.01mol/L,pH4.6的枸櫞酸鈉緩沖液)以誘發(fā)糖尿病;空白對(duì)照組僅注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液。72h后在大鼠尾靜脈采血,用血糖儀檢測(cè)血糖濃度,凡空腹血糖濃度≥16.7mmol/L,尿量及飲水量均明顯增多者視為造模成功的糖尿病大鼠。實(shí)驗(yàn)期間正常飲食,定期測(cè)量血糖及體重。3.取材與組織學(xué)處理:分別于造模成功后的1個(gè)月、3個(gè)月和5個(gè)月時(shí)用過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,迅速摘除眼球。①眼球摘除后立即固定于Verhoeff液中,48h后常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)6μm切片用于HE染色;②脫蠟:二甲苯Ⅰ脫蠟10min,二甲苯Ⅱ脫蠟5min;③乙醇浸泡;④蘇木精染色;⑤1%鹽酸乙醇分化;⑥1%稀氨水反藍(lán);⑦伊紅染色;⑧乙醇脫水;⑨二甲苯透明;⑩中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察。4.透射電鏡標(biāo)本制備:①部分眼球摘除后立即去掉眼前節(jié),浸入2.5%戊二醛溶液,取視網(wǎng)膜;②4%戊二醛前固定1h;③磷酸緩沖液沖洗2h;④1%鋨酸后固定1h;⑤乙醇脫水;⑥Epon環(huán)氧樹脂包埋;⑦聚合35℃、45℃、55℃各12h;⑧半薄切片光學(xué)定位(1μm),超薄切片機(jī)切片(70nm);⑨電子染色、醋酸鈾、枸椽酸鉛各15min;⑩透射電鏡下觀察并拍片。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布采用中位數(shù)(4分位間距),M(Q)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖尿病患者視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)表征1.一般狀態(tài):空白對(duì)照組大鼠的飲食、飲水及尿量均正常,體重隨著周齡增大而逐漸增加,血糖正常,毛色光滑柔軟,精神狀況良好,行動(dòng)靈活。糖尿病組大鼠每日的飲水、飲食及尿量明顯增多,體重下降,血糖明顯升高,毛色萎黃,精神萎靡,行動(dòng)遲緩(表1)。2.普通病理HE染色:空白對(duì)照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞形態(tài)正常,排列緊密(圖1A)。糖尿病1個(gè)月組視網(wǎng)膜內(nèi)、外顆粒層界限不清楚,細(xì)胞稀疏,排列稍紊亂,內(nèi)、外網(wǎng)狀層可見空泡(圖1B);糖尿病3個(gè)月組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)、外核層水腫;內(nèi)、外顆粒層變薄,且界限不清楚,細(xì)胞稀疏,排列紊亂,出現(xiàn)空泡樣變(圖1C);糖尿病5個(gè)月組視網(wǎng)膜水腫較3個(gè)月重,內(nèi)、外顆粒層細(xì)胞排列紊亂,界線消失,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和顆粒層空泡樣變性明顯,可見血管樣結(jié)構(gòu)(圖1D)。3.視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞平均個(gè)數(shù)變化:在每張HE染色切片上隨機(jī)選取20個(gè)相同固定面積、不重疊高倍(640倍)視野進(jìn)行圖像分析,采用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)v6.0A,測(cè)定染色的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞平均個(gè)數(shù)。與空白對(duì)照組比較,糖尿病1個(gè)月組和糖尿病3個(gè)月組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);糖尿病5個(gè)月組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,表2)。4.透射電鏡觀察:空白對(duì)照組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞核扁平,核內(nèi)染色質(zhì)密度高,色素顆粒較多,線粒體嵴清晰,細(xì)胞表面纖毛較多,內(nèi)、外顆粒層細(xì)胞排列規(guī)則,視細(xì)胞膜盤結(jié)構(gòu)清晰,排列整齊,血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)完好(圖2A)。糖尿病1個(gè)月組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞核固縮,核膜增厚,核內(nèi)染色質(zhì)凝聚,色素顆粒減少,細(xì)胞表面纖毛倒伏,視細(xì)胞膜盤結(jié)構(gòu)部分溶解,外顆粒層細(xì)胞間隙增寬,血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)完好(圖2B);糖尿病3個(gè)月組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞色素顆粒減少,細(xì)胞表面纖毛溶解,線粒體嵴斷裂,視細(xì)胞膜盤結(jié)構(gòu)溶解,外顆粒層細(xì)胞減少,排列紊亂,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)不清(圖2C);糖尿病5個(gè)月組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞色素顆粒明顯減少,細(xì)胞表面纖毛溶解,線粒體嵴斷裂,視細(xì)胞膜盤消失,外顆粒細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)空泡樣變,內(nèi)網(wǎng)狀層形成大的空泡,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞溶解,膜結(jié)構(gòu)完全消失(圖2D)。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化的一般情況糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最嚴(yán)重且最常見的微血管并發(fā)癥之一,也是最常見的致盲性眼病之一［1］。它的發(fā)病與糖尿病的病程和血糖異常的嚴(yán)重程度直接相關(guān)［3］。DR的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,因此建立理想的糖尿病動(dòng)物模型是研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要基礎(chǔ)。研究人員從1960年開始使用STZ誘發(fā)動(dòng)物糖尿病模型,STZ能夠直接損傷胰島β細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素分泌減少,血糖升高,產(chǎn)生糖尿病,目前已經(jīng)成為廣泛使用的誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型的化學(xué)制劑［4，5］。本研究采用經(jīng)典的STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的模型制作方法,結(jié)果成功建立了DR模型。從大鼠的一般情況可看出,腹腔注射STZ后大鼠表現(xiàn)出多飲、多食、多尿,大部分大鼠的體重下降,與空白對(duì)照組比較生長(zhǎng)緩慢,與糖尿病的臨床表現(xiàn)相符,表示造模成功(表1)。HE染色后可見糖尿病1個(gè)月組大鼠即出現(xiàn)視網(wǎng)膜改變,至5個(gè)月時(shí)視網(wǎng)膜病理改變明顯,并可見血管樣結(jié)構(gòu)。同時(shí)筆者在每張HE染色切片上進(jìn)行圖像分析,測(cè)定染色的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞平均個(gè)數(shù),與空白對(duì)照組比較,糖尿病1個(gè)月組和糖尿病3個(gè)月組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞平均個(gè)數(shù)減少(P<0.05);糖尿病5個(gè)月組明顯減少(P<0.000)。另外,筆者還通過(guò)透射電鏡觀察STZ大鼠視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,在糖尿病1個(gè)月組大鼠即出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,隨著病情進(jìn)展逐漸加重,至5個(gè)月時(shí)組線粒體嵴斷裂,出現(xiàn)空泡樣變,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞溶解,膜結(jié)構(gòu)完全消失。通過(guò)以上STZ大鼠視網(wǎng)膜HE染色和透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察,筆者認(rèn)為,本模型可以用作糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制及治療的研究。STZ誘發(fā)大鼠糖尿病模型被認(rèn)為是最常用的有效且經(jīng)濟(jì)的方法,包括靜脈注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等,通過(guò)腹腔內(nèi)或靜脈一次性給藥,均能取得良好的模型效果［6，7］。但本模型對(duì)STZ的配制要求較高,因?yàn)镾TZ溶液極其不穩(wěn)定,應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用,且4