葛根總黃酮逆轉(zhuǎn)sz誘導(dǎo)糖尿病小鼠胰腺損傷

葛根總黃酮逆轉(zhuǎn)sz誘導(dǎo)糖尿病小鼠胰腺損傷

結(jié)果表明，傳統(tǒng)中醫(yī)葛根含有黃酮類、官根素糖苷、葛根素、養(yǎng)分、氨基酸等活性物質(zhì)。并具有舒張平滑肌,改善心腦血管,護(hù)肝作用,抗癌作用,提高記憶功能和降血糖作用等廣泛的藥理功效。本實(shí)驗(yàn)擬腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)復(fù)制糖尿病小鼠模型,以糖代謝和氧化應(yīng)激為主要研究目標(biāo),探討葛根總黃酮對(duì)糖尿病小鼠的治療作用及其機(jī)制,為其早期防治糖尿病的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1材料表面1.1動(dòng)物許可證及小學(xué)成員昆明種小鼠,SPF級(jí),雌雄各半,體重(20±2)g,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK桂2009-0002,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝食、飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)于符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求的飼養(yǎng)環(huán)境中。1.2試劑與檢測(cè)方法二甲雙胍片(深圳市中聯(lián)制藥有限公司,批號(hào)20120618)。鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司,批號(hào)8008193462)。血糖試劑盒(四川邁克科技股份有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號(hào)20120736)。胰島素(Ins)放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品,批號(hào)111259)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)試劑盒:(均購于南京建成生物工程研究所,批號(hào)20120718),血紅素加氧酶1(HO-1)蛋白抗體(BioworldTechnology,Inc,USA,批號(hào)BS1432),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)20120704),SDS蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所,批號(hào)DZ12078),多克隆抗體(SantaCruzBiotechnology,批號(hào)SC-1293),HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體(SantaCruzBiotechnology,批號(hào)SC-1256)。預(yù)染蛋白Marker(Fermentas公司,批號(hào)SM120711)。1.3儀器和檢測(cè)方法722S紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司),DFM-96型多管放射放射免疫計(jì)數(shù)器(眾成機(jī)電技術(shù)公司),WBZ-2微波真空干燥機(jī)(貴陽新奇微波工業(yè)有限責(zé)任公司),DDL-5高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),5810型高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司),2235型病理組織切片機(jī)(德國Leitz公司),DMR+550型病理圖像分析儀(德國萊卡公司)。垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜及顯影設(shè)備(BIO-RAD公司),酶免分析儀(美國ThermoForma公司)。2方法2.1根總黃酮的提取葛根干燥粗粉1000g,加65%乙醇9000mL,回流4次,每次5h,趁熱過濾,濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,將濃縮物溶解后,高速離心15min,重復(fù)3次,所得沉淀物加適量90%乙醇溶解后過濾,濾液用1∶3石油醚萃取,棄上層醚相,萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,再經(jīng)蒸發(fā)皿用水浴蒸發(fā)至析出沉淀,沉淀重結(jié)晶即得葛根總黃酮。Sevage法除去蛋白質(zhì),經(jīng)檢測(cè)為黃酮類化合物即可使用。2.2mgk-1造模前禁食12h,一次性ip鏈脲佐菌素150mg·kg-1。3d后眼內(nèi)眥采血測(cè)空腹血糖(FBG)水平,選取FBG≥11.1mmol·L-1的小鼠作為糖尿病模型,共50只供實(shí)驗(yàn)使用。2.3正常組和模型組將糖尿病小鼠隨機(jī)分成5組(每組10只):模型組、二甲雙胍陽性組及葛根總黃酮低、中、高劑量組。并設(shè)立正常組(10只健康小鼠)。ig給予葛根總黃酮80,160,240mg·kg-1,陽性組給予二甲雙胍80mg·kg-1,正常組及模型組則給予等量生理鹽水,持續(xù)給藥14d。末次給藥前禁食12h,給藥1h后摘眼球取血,離心取血清待測(cè)。2.4elisa法檢測(cè)胰腺組織中g(shù)sh-px、sod,ros,mda及ho-1的表達(dá)采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖(FBG)水平。放射免疫法檢測(cè)血清空腹胰島素(FIns)及胰島素抵抗(IR)水平。ELISA法檢測(cè)胰腺組織中GSH-Px,SOD,ROS,MDA含量。HE染色觀察胰腺細(xì)胞病理學(xué)的變化。Westernblot法檢測(cè)胰臟HO-1的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)操作過程均嚴(yán)格按照廠家說明書指導(dǎo)進(jìn)行。2.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0軟件,數(shù)據(jù)以x珋±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1提示造模成功與否治療前模型組和其他給藥組的小鼠FBG明顯升高,與正常組比較差別有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。提示造模成功。治療后,二甲雙胍和葛根總黃酮有效地降低糖尿病小鼠FBG水平,與模型組比較差別有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。見表1。3.2正常組和正常組抗ir的比較糖尿病小鼠血清中FIns水平明顯上升,表現(xiàn)出顯著地胰島素抵抗(IR),與正常組比較差別有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。經(jīng)藥物干預(yù)后,二甲雙胍和葛根總黃酮有效降低FIns水平,改善IR狀況,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。3.3兩組a、c組a水平比較模型組糖尿病小鼠胰腺組織中GSH-Px,SOD活性明顯下降,而ROS,MDA水平升高,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給藥后,二甲雙胍組和葛根總黃酮組小鼠胰腺組織中GSH-Px,SOD活性顯著上升,而ROS,MDA水平逐漸降低,與模型組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。3.4兩組患者一般資料比較,見表1Westernblot結(jié)果表明,糖尿病小鼠胰臟中HO-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào),與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。藥物干預(yù)后,二甲雙胍和葛根總黃酮有效地下調(diào)糖尿病小鼠胰臟中HO-1蛋白表達(dá),與模型組比較差別有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。見表4。3.5中對(duì)胰島結(jié)構(gòu)的影響HE染色結(jié)果顯示,正常組胰島是結(jié)構(gòu)完整,β細(xì)胞排列有序,輪廓清晰可見,β細(xì)胞數(shù)量豐富。模型組中胰島結(jié)構(gòu)受損,β細(xì)胞減少,并伴有變性或壞死,偶見炎癥浸潤(rùn)。二甲雙胍組胰島形態(tài)有一定恢復(fù),β細(xì)胞數(shù)量增加。葛根總黃酮低劑量組胰島β細(xì)胞減少,但其形態(tài)有一定的修復(fù)。中劑量組(圖E)胰島結(jié)構(gòu)有所改善,β細(xì)胞數(shù)量逐漸回增。高劑量組胰島結(jié)構(gòu)恢復(fù),β細(xì)胞密度增加明顯。見圖1。4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)糖尿病是一種慢性疾病,其主要病因是胰島素分泌不足或產(chǎn)生胰島素抵抗,最終會(huì)導(dǎo)致血糖代謝紊亂而引發(fā)系列的嚴(yán)重并發(fā)癥。因此,有效地恢復(fù)胰島素、血糖的穩(wěn)態(tài)水平是抗糖尿病中藥(新藥)篩選的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中,給予葛根總黃酮梯度劑量治療后,STZ所致的糖尿病小鼠高血糖病況逐漸地降低,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。表明葛根總黃酮能具有改善胰島素敏感性以及降血糖作用。研究發(fā)現(xiàn),胰島β細(xì)胞功能障礙是糖尿病主要發(fā)病機(jī)制之一。高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性損傷會(huì)引起胰島素調(diào)控能力下降,使其合成分泌減少,同時(shí)β細(xì)胞功能衰退,將進(jìn)一步加劇代謝紊亂。而對(duì)抗活性氧(ROS)介導(dǎo)的細(xì)胞損傷是治療糖尿病的有效策略之一。本實(shí)驗(yàn)中,STZ所致的糖尿病小鼠胰腺組織中抗氧化酶活性明顯降低,而脂毒性物質(zhì)MDA含量累積。同時(shí)HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島結(jié)構(gòu)受損,β細(xì)胞變性或壞。提示STZ誘發(fā)糖尿病小鼠產(chǎn)生了氧化應(yīng)激性損傷。而葛根總黃酮治療能有效地增加其胰腺組織中GSH-Px,SOD活性,并降低ROS,MDA水平。表明葛根總黃酮具有提高糖尿病小鼠抗氧化應(yīng)激能力以及減輕脂毒性作用。正常生理狀況下,血紅素加氧酶1(HO-1)主要存在代謝活躍的組織中,如胰腺。當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時(shí),HO-1被過度激活并產(chǎn)生大量游離鉄離子和CO在內(nèi)環(huán)境下進(jìn)一步加重氧化損傷,破壞線粒體而干擾呼吸供能途徑。本實(shí)驗(yàn)中,STZ所致的糖尿病小鼠胰腺組織中內(nèi)源性HO-1蛋白顯著高于正常對(duì)照小鼠,提示STZ化學(xué)物質(zhì)因