dna重組技術(shù)在植物寄主線蟲分類上的應用

dna重組技術(shù)在植物寄主線蟲分類上的應用

1線蟲新種和分類植物寄生蟲昆蟲的分類目標是盡可能簡單地闡明昆蟲的種類、多樣性、它們的相互關(guān)系和進化歷史。為了實現(xiàn)這個目標,各種分類技術(shù)隨著科學技術(shù)的進步而應用到線蟲中。縱觀植物寄生線蟲分類學的發(fā)展過程,線蟲分類主要以形態(tài)學分類為主,兼以生態(tài)學及生物學特征。以后,隨著電子計算機的發(fā)展,把用于形態(tài)分類的指標數(shù)量化,應用聚類分析法而建立了線蟲的數(shù)值分類法。電子顯微鏡的應用促進了形態(tài)學的發(fā)展,同時也對光學顯微鏡下的形態(tài)分類提出了新的挑戰(zhàn),因為原本在光學顯微鏡下相似的形態(tài)結(jié)構(gòu),在電子顯微鏡下差別卻很大,而電子顯微鏡的昂貴的費用和制片過程也限制了它在日常鑒定中的應用。隨著線蟲學科的發(fā)展,愈來愈多的線蟲新種被發(fā)現(xiàn),且與原來已鑒定的種從形態(tài)上較難區(qū)分,另外又由于地理隔離,不同國家的線蟲分類學家對同一種線蟲定名的同物異名現(xiàn)象時有發(fā)生。隨著抗線蟲育種的發(fā)展,對具有嚴重危害性的植物寄生線蟲如短體線蟲Pratylenchusspp.、莖線蟲Ditylenchusspp.、根結(jié)線蟲Meloidogynespp.、胞囊線蟲Heteroderaspp.、球形胞囊線蟲Globoderaspp.、松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus以及劍線蟲Xiphinemaspp.的鑒定提出了更高的要求。由于這些線蟲對寄主的侵染存在著明顯的侵染?；?因此對這些種的鑒定必須做到準確無誤。由于形態(tài)學指標受環(huán)境影響較大,為尋求比較客觀、準確的鑒定依據(jù),線蟲學家用線蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)或酶的成分為指標,對線蟲進行鑒定,因而產(chǎn)生了線蟲蛋白質(zhì)及酶的電泳分類法及免疫學分類法。這些技術(shù)被較好地應用于區(qū)分根結(jié)線蟲的幾種常見種。DalmassoA等實現(xiàn)了用一條根結(jié)線蟲雌蟲的酶則足以達到鑒定目的,效果相當穩(wěn)定,已用于日常鑒定中。但是以線蟲蛋白質(zhì)或酶為基礎的電泳分類法及免疫分類法只適用于少數(shù)幾種線蟲,且除根結(jié)線蟲可以用一條線蟲作為鑒定依據(jù)外,其他種線蟲需要提取線蟲的酶或蛋白質(zhì)之后,才能進行鑒定。有些線蟲的酶或蛋白質(zhì)的提取過程比較復雜,且易受植物組織的污染,從而限制了這種方法的使用范圍。利用不受環(huán)境條件影響的線蟲遺傳物質(zhì)DNA對線蟲進行分類是于80年代中期,隨DNA重組技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來的,主要用于鑒定經(jīng)濟上比較重要的植物病原線蟲如:根結(jié)線蟲、馬鈴薯白線蟲(G.pallida)、短體線蟲、松材線蟲及傳毒線蟲劍線蟲等。利用線蟲遺傳物質(zhì)DNA重組技術(shù)進行分類,依分類目的及所需要的DNA的量,可分為二個階段。第一個階段是從大量純培養(yǎng)線蟲中提取DNA,用于進行DNA多態(tài)性分析,從而研究線蟲的生物多樣性及屬內(nèi)或種內(nèi)變異規(guī)律;第二階段是以單條線蟲的DNA為基礎,對線蟲進行快速、精確鑒定。2啟動dns-slat技術(shù)用于植物寄生蟲線蟲的分類2.1rapd技術(shù)在非選擇性dna片段電泳、染色、聚類分析、鑒定的應用DNA重組技術(shù)在線蟲的生物多樣性及屬內(nèi)或種內(nèi)變異規(guī)律研究中的應用,主要以RFLP及RAPD技術(shù)為代表。RFLP技術(shù)主要是利用DNA分子核苷酸序列的兩個基本特性,首先是它能被具有識別特定堿基片段并在該位點準確將其切斷的限制性內(nèi)切酶精確地切斷,然后把這些被切開了的DNA片段在瓊膠上進行電泳,把電泳帶回收到固體支持物如尼龍膜上或其他支持物上,最后把它們和標記過的DNA探針進行雜交,從而證明不同種線蟲的限制性DNA片段的多態(tài)性并利用這些多態(tài)性對線蟲進行區(qū)別。這個方法是逐步發(fā)展起來的。最早是用被限制性內(nèi)切酶消解后的基因組DNA片段或線粒體DNA片段直接進行電泳、染色,并在260nm條件下觀察電泳結(jié)果。由于電泳帶太多,結(jié)果較難分析。后來用同位素標記的同源或異源的DNA探針和回收的DNA片段進行雜交,使這項技術(shù)能夠在種間或種內(nèi)水平上區(qū)分不同種的線蟲。RAPD技術(shù)使用單一一對引物對線蟲的DNA進行隨機擴增之后,經(jīng)電泳、染色,并在260nm的條件下觀察電泳結(jié)果,將不同種線蟲的非限制性DNA片段的多態(tài)性顯示出來,用聚類分析方法對這些片段進行多態(tài)性分析,用于種的鑒定及種與種之間的親緣關(guān)系的分析。由于這兩種方法一般都需要大量的純培養(yǎng)線蟲提取DNA,因而,在日常使用中受到限制。2.2利用衛(wèi)星dna探針和pcr引物進行同時鑒定DNA重組技術(shù)對單條線蟲的精確鑒定,主要是利用線蟲染色體DNA的保守區(qū)域,如作用不明的衛(wèi)星DNA及核糖體DNA的非轉(zhuǎn)錄(ITS)片段進行鑒定。這兩種方法使用特定的衛(wèi)星DNA引物或ITS引物對線蟲DNA通過聚合酶鏈式反應(PCR),對線蟲DNA進行擴增,擴增出相應的衛(wèi)星DNA片段或ITS片段,對這些片段進行測序,設計合成PCR特異性引物。然后用單條線蟲進行PCR反應,得到該種線蟲的特異性片段,經(jīng)過電泳、染色即可看出結(jié)果。目前這種方法已經(jīng)成功地鑒定重要的病原線蟲。如PiotteC.成功地用根結(jié)線蟲衛(wèi)星DNA的PCR引物把北方根結(jié)線蟲M.hapla、花生根結(jié)線蟲M.arenaria及南方根結(jié)線蟲M.ingonita區(qū)分開來,而且還可以區(qū)分北方根結(jié)線蟲的3個地理小種“England”、“Frontignan”及“Lamole”小種。UeharaT.等成功地用ITS特異性引物區(qū)分了2種短體線蟲P.coffeae及P.Loosi。王新榮等成功地用ITS的特異性引物鑒定了3種劍線蟲X.index,X.diversicaudatum,X.viuttenezi等等?，F(xiàn)在進一步發(fā)展到,在單條線蟲DNA的基礎上,利用多對PCR引物對一個屬的多種線蟲進行同時鑒定,如WilliamsonV.M.可以通過1次PCR反應,利用兩對PCR引物將北方根結(jié)線蟲或奇特伍德根結(jié)線蟲M.chitwoodi從這兩種線蟲的混合物中,同時鑒定出來。對劍線蟲的混合樣品的一次PCR鑒定技術(shù)正在法國農(nóng)業(yè)科學研究院Antibes研究中心植物健康與環(huán)境研究所進行。這大大簡化了用DNA重組技術(shù)進行線蟲分類的程序。在這個基礎上,可以發(fā)展用化學標記的衛(wèi)星DNA探針或ITS探針直接和單條線蟲進行DNA雜交,并可發(fā)展到用常規(guī)染色法對線蟲進行鑒定。以后還可以開發(fā)基因芯片,達到對線蟲快速、準確鑒定的目的。目前法國農(nóng)業(yè)科學研究院Antibes研究中心植物健康與環(huán)境研究所等實驗室正在進行此方面的研究。2.3線蟲及線蟲到目前為止,DNA重組技術(shù)主要用于鑒定重要病原線蟲的種及小種,如松材線蟲、根結(jié)線蟲、短體線蟲、胞囊線蟲、球形胞囊線蟲、莖線蟲及劍線蟲等。在建立植物寄生線蟲分類系統(tǒng)上的應用方面,除了對個別種或小種的分類位置進行局部調(diào)整外,以該項技術(shù)為基礎的更高一級分類界元的確定,目前涉及很少。3dna重組技術(shù)利用DNA重組技術(shù)對線蟲進行分類,為解決生產(chǎn)上重要病原線蟲的種間及種內(nèi)水平的準確鑒定提供了強有力的輔助工具。但是,用DNA重組技術(shù)對線蟲進行鑒定,還處于研究試驗階段,都是先通過形態(tài)分類,知道是什么種或相似種之后,再用相應DNA重組技術(shù)進行檢驗。形態(tài)學分類以其直觀、簡單和經(jīng)濟而廣泛使用,當種或小種的區(qū)別不明顯時,才用DNA重組技術(shù)進行鑒定。隨著科學技術(shù)的發(fā)展,對某種重要的病原線蟲