肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型肺血管重構(gòu)模式的比較研究

肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型肺血管重構(gòu)模式的比較研究

動(dòng)脈高壓（ph）是心血管領(lǐng)域的一種常見疾病。目前常用慢性低氧、野百合堿(monocrotaline,MCT)注射、單純左肺切除(pneumonectomy,PE)和腹主動(dòng)脈-腔靜脈分流(abdominalaortocavalfistulashunting,A-VF)等方法建立的動(dòng)物模型來研究肺動(dòng)脈高壓,但這些模型均不能形成人類嚴(yán)重PH特征性的病理學(xué)改變,如叢狀病變與新生內(nèi)膜(neointima)的形成。藥物損傷加上血流動(dòng)力學(xué)的改變能調(diào)節(jié)肺血管重構(gòu)模式。本研究通過比較左肺切除聯(lián)合MCT(PE+MCT)、MCT、PE和A-VF4種方法建立的大鼠肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)模式的差異,為肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的防治研究尋找一種更為適用的動(dòng)物模型。材料和方法1動(dòng)物的體外培育健康雄性SD大鼠52只,體重350-400g,隨機(jī)分為5組:左肺切除組(PE,n=10):在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上略加改動(dòng)。動(dòng)物術(shù)后吸氧24h(每籠2L·min-1,30%O2),以后吸常氧至處死。分流組(A-VF,n=10):參照文獻(xiàn)行腹主動(dòng)脈-腔靜脈分流術(shù)。野百合堿組(MCT,n=10):參照文獻(xiàn)將MCT溶解于適量0.5mol/LHCl,用0.5mol/LNaOH將pH調(diào)整至7.4,于動(dòng)物項(xiàng)背部皮下注射60mg/kg。肺切除+野百合堿組(PE+MCT,n=12):動(dòng)物于左肺切除術(shù)后1周于項(xiàng)背部皮下注射相同劑量MCT。對(duì)照組(n=10):不給予任何處理。2麻醉后mpap檢測(cè)所有動(dòng)物均在處理后5周(PE+MCT組,注射MCT后4周)用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔麻醉,經(jīng)頸外靜脈插管,用PM-8000型多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)mPAP。3右室重量測(cè)壓后處死動(dòng)物,游離右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S),并分別稱重計(jì)算RV/(LV+S)比值。4常規(guī)染色—肺組織的準(zhǔn)備右肺用生理鹽水通過肺動(dòng)脈沖洗剩余的血液,同時(shí)用10%中性甲醛在20cmH2O壓力下經(jīng)氣管緩慢注入肺內(nèi),使肺表面平滑膨脹,約5min后切取右下肺,于10%中性甲醛液中固定48h,常規(guī)石蠟包埋、切片,進(jìn)行HE、Elastin-VanGieson和平滑肌細(xì)胞α-actin免疫組化染色。5新生運(yùn)營狀態(tài)400倍光鏡觀察Elastin-VanGieson染色切片,每只動(dòng)物隨機(jī)觀察50根管徑在15-100μm的肺小動(dòng)脈。內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)與內(nèi)彈力板之間部分即為新生內(nèi)膜。新生內(nèi)膜增殖度(%)=新生內(nèi)膜血管數(shù)/50×100%。參照文獻(xiàn)進(jìn)行VOS計(jì)分:無新生內(nèi)膜形成為0分;血管腔阻塞<50%為1分;血管腔阻塞>50%為2分。6外作用力板平均直徑的測(cè)定400倍光鏡觀察Elastin-VanGieson染色切片,在SimplePCI圖像采集處理系統(tǒng)中,用光標(biāo)勾劃出內(nèi)、外彈力板的輪廓,分別測(cè)定內(nèi)、外彈力板的平均直徑,計(jì)算肺小動(dòng)脈(每只動(dòng)物30-40根,直徑在50-150μm之間)的中膜厚度(內(nèi)、外彈力板之間的厚度,WT)和血管的外徑(外彈力板的平均直徑,ED)。根據(jù)公式計(jì)算中膜厚度百分比:WT%=(2×WT/ED)×100%。7小鼠腺泡內(nèi)小動(dòng)脈的染色400倍光鏡觀察α-actin(BosterBiologicalTechnologyLtd)免疫組化染色切片,每只動(dòng)物隨機(jī)觀察20個(gè)高倍視野,統(tǒng)計(jì)直徑在15-50μm的腺泡內(nèi)小動(dòng)脈(30-60根)。根據(jù)α-actin染色陽性程度分別計(jì)數(shù)完全肌化(中膜有完整的肌層)、部分肌化(中膜肌層不完整)和無肌化的小動(dòng)脈(沒有明顯的肌層)。無肌性血管肌化程度(muscularization%)=(完全肌化+部分肌化的血管數(shù))/觀察血管總數(shù)×100%。對(duì)每只動(dòng)物α-actin免疫組化染色切片用Image-ProPlus軟件掃描作積分光密度(IA)值半定量分析,每只動(dòng)物隨機(jī)觀察20個(gè)高倍視野取平均值。8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析,組間均數(shù)兩兩比較采用LSD法,實(shí)驗(yàn)前后體重比較采用t檢驗(yàn),應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果1動(dòng)物皮膚急性毒性表現(xiàn)結(jié)果表1PE+MCT組動(dòng)物在注射MCT后4周出現(xiàn)松毛、活動(dòng)減少、呼吸急促、舌黏膜發(fā)紺、肝腫大等表現(xiàn),其中1只出現(xiàn)4肢及腹部皮膚明顯水腫,4只死亡。其它組無死亡,上述表現(xiàn)輕微。PE+MCT組動(dòng)物在注射MCT后約1周出現(xiàn)體重不增,以后體重逐漸下降(P<0.01)。對(duì)照組和其它模型組動(dòng)物體重均有不同程度的增加(表1),P<0.01。2已使用一定的程序,即營造良好的氛圍。p>0.0.04種PH模型mPAP均有不同程度升高(P<0.01)。PE+MCT組mPAP較A-VF組、PE組和MCT組升高更為明顯(P<0.01),見表1。3兩組p>0.1不同PH模型組RV/(LV+S)比值明顯大于對(duì)照組(P<0.01)。PE+MCT組右心室肥大程度較A-VF組、PE組和MCT組更加顯著(P<0.01),見表1。4動(dòng)物腺泡內(nèi)小動(dòng)脈新生內(nèi)皮增殖度PE+MCT組動(dòng)物右肺腺泡內(nèi)小動(dòng)脈管壁、管腔和內(nèi)外彈力板(花邊樣),在內(nèi)彈力板內(nèi)側(cè)與內(nèi)皮之間可見新生內(nèi)膜形成,管腔不同程度狹窄,部分嚴(yán)重者管腔已完全閉塞(圖1B),新生內(nèi)膜增殖度可達(dá)88.5%,VOS為1.71±0.13。對(duì)照組、A-VF組、PE組和MCT組動(dòng)物腺泡內(nèi)小動(dòng)脈均無新生內(nèi)膜形成和血管腔阻塞,新生內(nèi)膜增殖度和VOS均為0?！霵<0.01vsinitialbodyweight;*P<0.01vscontrol;△P<0.01vsothergroups;ue5f6P>0.05vsgroupA-VF.5組大鼠血清a-vf的比較各模型組肺小動(dòng)脈中膜有不同程度增厚(圖2)。中膜厚度百分比(WT%)均較對(duì)照組明顯增加(A-VF組與對(duì)照組比較,P<0.05;PE組、MCT組和PE+MCT組與對(duì)照組比較,P<0.01),見表2。PE+MCT組動(dòng)物肺小動(dòng)脈中膜增厚較A-VF組、PE組和MCT組更加顯著(P<0.01)。6各組肺小動(dòng)脈新生說1各模型組腺泡內(nèi)肺小動(dòng)脈肌化程度均較對(duì)照組顯著增加(P<0.01);PE+MCT組動(dòng)物肺小動(dòng)脈肌化程度較A-VF組、PE組和MCT組增加更顯著(P<0.01),見表2。PE+MCT組肺小動(dòng)脈新生內(nèi)膜中大部分細(xì)胞α-actin染色陽性,見圖3B。各模型組α-actin免疫組化染色I(xiàn)A值均較對(duì)照組有明顯增高(P<0.05,或P<0.01);PE+MCT組α-actin免疫組化染色I(xiàn)A值較A-VF、PE和MCT組增高更為顯著(P<0.01),見表2。肺血管重構(gòu)模式的比較肺動(dòng)脈高壓(PH)表現(xiàn)為肺動(dòng)脈阻力進(jìn)行性增加,最終導(dǎo)致肺血管梗阻性病變和不良預(yù)后,其典型代表是原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓和左向右分流導(dǎo)致的繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓癥。在PH的早期,收縮和舒張的活性物質(zhì)失衡及小動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)收縮,繼而SMC增生、肥厚,進(jìn)而出現(xiàn)以新生內(nèi)膜形成為先導(dǎo)的不可逆轉(zhuǎn)的一系列病理形態(tài)學(xué)改變,包括管腔橫截面的急劇縮小、血管壁纖維化、壞死性動(dòng)脈炎、外膜增厚和擴(kuò)張性病變?nèi)鐓矤畈∽兊男纬?。新生?nèi)膜見于PH的Heath-Edwards分級(jí)II級(jí)以上病變,是進(jìn)行性PH區(qū)別于可逆輕癥PH的病理學(xué)標(biāo)志。目前研究PH的多種模型,包括使用最為廣泛的低氧動(dòng)物模型在內(nèi),在病理學(xué)改變方面均不能完全模擬人類梗阻性PH肺血管重構(gòu)模式,尤其是不能形成新生內(nèi)膜。顯然,對(duì)于PH有關(guān)的臨床基礎(chǔ)研究,尤其是藥理學(xué)干預(yù)效果的研究以采用新生內(nèi)膜形成的肺血管重構(gòu)模型來進(jìn)行更為適宜。本研究首次對(duì)比了A-VF、MCT、PE和PE+MCT4種方法建立的PH模型在肺血管重構(gòu)模式方面的差異。結(jié)果顯示,PE+MCT組mPAP、右心室肥大、動(dòng)脈中膜增厚、小動(dòng)脈肌化程度及α-actin免疫組化染色I(xiàn)A值均較其它3種模型有明顯增加,最近文獻(xiàn)報(bào)道與本研究結(jié)果一致。PE+MCT組動(dòng)物在肺腺泡內(nèi)小動(dòng)脈有新生內(nèi)膜形成,但新生內(nèi)膜并非內(nèi)皮增生的結(jié)果。因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31+細(xì)胞僅見于血管腔面,表明增生的新生內(nèi)膜細(xì)胞中無內(nèi)皮細(xì)胞。而這些新生內(nèi)膜中大部分細(xì)胞α-actin染色呈陽性(圖3),提示這些細(xì)胞主要來自動(dòng)脈中膜SMC,與SMC向內(nèi)皮下遷移、增生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)PE+MCT組動(dòng)物肺小動(dòng)脈廣泛新生內(nèi)膜增生,肺動(dòng)脈壓顯著增高,且出現(xiàn)右心擴(kuò)大、肝大、下肢浮腫和死亡率增加等心力衰竭表現(xiàn),因此可以說該動(dòng)物模型成功地模擬了梗阻性肺動(dòng)脈高壓。然而,僅有血管內(nèi)皮毒物損傷(如MCT)或血流動(dòng)力學(xué)改變(如體動(dòng)脈-腔靜脈分流)均不能造成新生內(nèi)膜形成。MCT預(yù)處理的動(dòng)物再制作鎖骨下動(dòng)脈與肺動(dòng)脈吻合后則出現(xiàn)了新生內(nèi)膜,提示只有將2種因素聯(lián)合應(yīng)用才能誘導(dǎo)新生內(nèi)膜形成的PH血管重構(gòu)特征。由于PE和A-VF方法建立的PH模型僅有分流而無MCT所致內(nèi)皮損傷,而MCT模型僅造成了內(nèi)皮損傷而無分流形成,這3種模型在病理組織學(xué)上均沒有新生內(nèi)膜形成,僅表現(xiàn)為動(dòng)脈中膜增厚為主的肺血管重構(gòu)模式,可能與其肺血管重構(gòu)的始動(dòng)因素為單一內(nèi)皮損傷或血流動(dòng)力學(xué)改變有關(guān)。而本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了在MCT注射的大鼠,血流動(dòng)力學(xué)因素包括剪切應(yīng)力和壓力改變促進(jìn)了肺血管重構(gòu)模式的改變。血流動(dòng)力學(xué)因素促進(jìn)PH肺血管重構(gòu)的確切機(jī)制尚未闡明,但是與體循環(huán)高血壓的發(fā)生機(jī)制相似,PH肺血管重構(gòu)的發(fā)生與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。內(nèi)皮屏障功能受損,血漿因子進(jìn)入管壁,各種促增殖介質(zhì)(血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1、5-羥色胺、各種生長因子、炎癥因子等)生成增加并與血管基質(zhì)和SMC接觸,使后者肥厚和增生,可能就是內(nèi)皮損傷導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制之一。MCT造成內(nèi)皮損傷后,肺動(dòng)脈壓力亦有相應(yīng)的升高,但組織學(xué)觀察并未發(fā)現(xiàn)有明顯的新生內(nèi)膜形