鎖陽種子的清除、硬實(shí)清除及生活力測定

鎖陽種子的清除、硬實(shí)清除及生活力測定

鎖陽是鎖定科的多年生草本種子植物（馬玉泉，1989），主要屬于蓮藕科，屬于白刺科，屬于統(tǒng)治者（陳葉等人2010年），羅伊伯科（王進(jìn)等人2011年）植物的根部。于寄主的分布系統(tǒng)相同,鎖陽多生于干旱沙漠地帶及荒漠區(qū)的湖盆邊緣和洪積、沖積扇緣地帶的鹽漬化沙地(馬毓泉1989;黃林芳等2010),被列為名貴中藥材的上品,素有“沙漠人參”之稱?，F(xiàn)代研究表明,鎖陽在抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體免疫、延緩衰老和防治心血管疾病等方面也具有重要作用(國家藥典委員會2005;王一峰等2006;陶晶等1999)。除藥用價值外,鎖陽還可提煉栲膠,用于釀酒和飼料等。因此它具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價值(陳圓華等2005;張思巨和張淑運(yùn)1991)。近年來由于掠奪式采挖,使藥源不斷減少,鎖陽野生資源已處于瀕臨枯竭狀態(tài)(高永1996)。為拯救和保護(hù)鎖陽資源,結(jié)合生態(tài)恢復(fù)和鹽堿地改造,在西北干旱地區(qū)進(jìn)行人工種植鎖陽刻不容緩(金自學(xué)2001)。附屬物和種子硬實(shí)是物種傳播延續(xù)對環(huán)境的一種特殊適應(yīng),附屬物是為了更好的完成傳播途徑,而硬實(shí)特性是對極端環(huán)境的一種適應(yīng)(王進(jìn)等2010)。影響鎖陽種子發(fā)芽的原因之一就是種子表面的附屬物和本身具有的硬實(shí)特性。因此,對附屬物清除和硬實(shí)破除前處理顯得尤為重要。同時,種子生活力是種子發(fā)芽的潛在能力,對預(yù)測休眠種子的發(fā)芽力和快速預(yù)測種子發(fā)芽率具有重要意義。研究鎖陽種子生活力測定方法,對鎖陽種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、種子質(zhì)分級及提高接種率具有重要意義。在測定種子生活力的方法中,應(yīng)用最廣的是德國萊康(Lakon)于1942年提出的TTC(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride)法、紅墨水染色法、溴麝香酚藍(lán)染色法和離體胚培養(yǎng)法等(尹燕枰等1997;傅家瑞等1992;沈宇峰等2008)。本實(shí)驗(yàn)采用物理機(jī)械方法和化學(xué)方法,清除種子外的附屬物質(zhì)及破除種子硬實(shí),后用TTC染色法、紅墨水染色法、溴麝香酚藍(lán)染色法、靛藍(lán)洋紅染色法和離體胚培養(yǎng)法處理去種皮種子,確定最佳方法,為進(jìn)一步了解鎖陽種子的萌發(fā)特性提供科學(xué)依據(jù)。材料和方法1不同規(guī)格種子的制備2008年8月于甘肅省武威市民勤縣泉山鎮(zhèn)西六村一社(38°51′N,103°23′E)海拔1334m處,采集到充分成熟的寄生于唐古特白刺根部的鎖陽(Cyno-moriumsongariaRupr)果穗,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)過脫粒清選精選,獲凈種子300g,置入4℃冷藏箱中備用。2測試方法2.1尼龍紗網(wǎng)一、制備法取鎖陽種子100粒,置入30mL燒杯中,用6種不同方法處理種子。(1)用500萬單位的果膠酶:纖維素酶(1:1)混合液在30℃下處理24h;(2)用開水燙種,冷至室溫浸種24h后用尼龍紗網(wǎng)搓揉;(3)用濃硫酸處理60min,用尼龍紗網(wǎng)搓揉;(4)用1%的NaOH溶液浸種3h;(5)用濃HCl浸種60min;(6)用10%的NaClO浸種60min。以冷水浸種24h后尼龍紗網(wǎng)搓揉的種子為對照,測定附屬物清除率。附屬物清除率(%)=清除附屬物的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。硬實(shí)率(%)=硬實(shí)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。每個處理重復(fù)4次。2.2硬實(shí)率的測定取開水燙種處理的種子,用1、2、3、4和5mol·L-1的NaOH處理0.5、1.0、1.5和2.0h,之后用蒸餾水浸泡24h,測定硬實(shí)率。同時用NaOH處理去皮的種子在20℃、36μmol·m-2·s-1的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)做離體胚培養(yǎng),測定生活力。以上每處理重復(fù)4次,每重復(fù)100粒種子。2.3種子處理和培養(yǎng)從種子中取出種仁,用0.1%的HgCl2消毒2min,用以下6種方法測定生活力。TTC染色法:用1%的TTC溶液在黑暗條件下35℃染色24h。溴麝香草酚藍(lán)法:將種子置于0.1%的溴麝香草酚藍(lán)(BTB)瓊脂凝膠薄層培養(yǎng)皿中,加蓋后置于35℃的恒溫箱中培養(yǎng)5h。紅墨水染色法:用5%的紅墨水在35℃下染色20min,倒去紅墨水后用水沖洗至溶液無色。靛藍(lán)洋紅染色法:用2%的靛藍(lán)洋紅在35℃下染色200min,倒去靛藍(lán)洋紅后用水沖洗至溶液無色。離體胚培養(yǎng)法:將種子置于培養(yǎng)皿,在20和25℃的恒溫箱中,在36μmol·m-2·s-1光照條件下培養(yǎng)15d。以上處理重復(fù)4次,每重復(fù)100粒種子,以用開水浸泡10min的種仁為對照處理。2.4差分析和新復(fù)偏差分析的差異顯著性以SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,以單因素方差分析(One-wayANOVA)最小顯著差法(LSD)和新復(fù)極差法(Dance)在0.05和0.01概率水平確定各平均值間的差異顯著性。分析結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。結(jié)果1不同處理種子硬實(shí)的效果其從表1可見,開水燙種處理和1%的NaOH溶液處理的種子附屬物清除率極顯著高于其他處理。果膠酶+纖維素酶混合液處理和NaClO處理種子對附屬物的清除有一定效果,但清除率極低。HCl處理對種子上的附屬物無清除。冷水浸種后紗布搓揉可使部分附屬物清除。從不同處理對種子硬實(shí)破除效果來看,NaOH處理的種子硬實(shí)率為12%,極顯著低于其他處理(P<0.01),其次是濃硫酸處理,第三為NaClO處理,其硬實(shí)率極顯著低于剩余4種處理(P<0.01),其他處理對硬實(shí)率無影響,仍然是100%。綜上所述,清除鎖陽種子附屬物最有效的方法是開水燙種處理和1%的NaOH溶液處理,破除硬實(shí)最有效的方法是NaOH溶液處理。2不同naoh處理對鎖陽種子致死率的影響從表2來看,同一NaOH濃度下,隨處理時間的延長,硬實(shí)率極顯著降低(P<0.01);而在相同時間處理下,隨NaOH濃度的提高,硬實(shí)率顯著降低(P<0.05)。1.0mol·L-1的NaOH處理5h、1.5mol·L-1的NaOH處理4~5h和2.0mol·L-1的NaOH處理3~5h都將硬實(shí)率降低為0。隨處理時間的延長,鎖陽種子致死率在同一濃度下顯著降低(P<0.05)。在相同時間處理下,隨NaOH濃度的提高,測定的種子致死率有降低趨勢。1.0mol·L-1的NaOH處理5h、1.5mol·L-1的NaOH處理4~5h和2.0mol·L-1的NaOH處理2~5h都將將致死率降低為0(表2)。鎖陽種子生活力很高,隨NaOH處理時間的延長和濃度的增加,種子致死率下降,破除鎖陽種子硬實(shí),去除種皮最適宜的方法是1.0moL·L-1的NaOH處理5h、1.5moL·L-1的NaOH處理4~5h、2.0moL·L-1的NaOH處理3~5h。3種子生活力的測定從TTC對種子的染色情況看,14%種仁通體鮮紅,86%種仁乳白色,無染色跡象(圖1-A),從TTC染色理論判斷,鎖陽種子生活力為14%。從溴麝香草酚藍(lán)染色情況看,20%種仁表面泛黃色,52%種仁乳白色,28%種子表面微呈藍(lán)色,種子周圍無藍(lán)色暈圈,完全死亡種子周圍有藍(lán)色暈圈(圖1-B),從其染色理論看,種子生活力為20%。從紅墨水染色情況看,20%種仁淺表染成粉紅色,80%種仁乳白色,無染色跡象(圖1-C),從其染色理論看,種子生活力為80%。從靛藍(lán)洋紅染色情況看,28%種仁通體染成淡藍(lán)色,72%種仁乳白色,無染色跡象(圖1-D),種子生活力為72%。從離體胚培養(yǎng)的結(jié)果來看,在25℃下培養(yǎng)的種仁,有3%的種仁遭霉菌污染,其余種仁新鮮有光澤且種仁長度增加(圖1-E),種子生活力為97%。在20℃下,所有種仁都新鮮有光澤,種仁長度增加(圖1-F),種子生活力為100%。TTC染色法和溴代麝香草酚藍(lán)法隨處理時間的延長和種子處理條件的改變,有生活力表現(xiàn)的種子會顯著增加。紅墨水染色法、靛藍(lán)洋紅染色法結(jié)論則與TTC染色法和溴代麝香草酚藍(lán)法相矛盾。綜上所述,鎖陽種仁質(zhì)地緊密,胚呼吸極弱,用快速染色的方法無法快速測定其生活力,25℃下離體培養(yǎng),會使部分種子遭受霉菌污染而散失生活力。測定鎖陽種子生活力的最佳方法是20℃光照條件下離體培養(yǎng)15d。討論1成熟環(huán)境的影響種子附屬物是種子上的保護(hù)物質(zhì),對物種的延續(xù)和在逆境中的繁衍具有重要意義,其成分與成熟環(huán)境和母體營養(yǎng)有關(guān)。生長在干旱荒漠中區(qū)鎖陽,其種子著生在富含淀粉的果穗表面,其表面的附屬物可能是淀粉、果膠和纖維類物質(zhì),因此遇到強(qiáng)酸或堿,就會因化學(xué)反應(yīng)而清除。在遇到熱水處理后用機(jī)械搓揉的辦法也可將其清除,說明附屬物與種子結(jié)合并不太緊密。2生活力的測定鎖陽種子細(xì)小圓滑且有堅硬的種皮,種子發(fā)芽緩慢,軟化種皮,使種仁外漏,是進(jìn)行生活力測定的前提。熱水處理、濃H2SO4化學(xué)處理、NaOH處理、砂紙機(jī)械處理和低溫冷凍處理是打破硬實(shí)種子休眠的有效方法,但結(jié)合鎖陽種子特征,選用NaOH溶液處理種子,使其種皮中的脂類溶解,色素析出,種子吸脹,硬實(shí)破除。3種仁離體胚培養(yǎng)法有研究認(rèn)為,硬實(shí)種子是充分成熟的種子,具有高活力。但該試驗(yàn)中,因鎖陽種子胚乳結(jié)構(gòu)致密,種胚呼吸弱,種胚深埋于胚乳中(蘇格爾和包玉英1999;李天然等1994),用TTC染色法、溴麝香草酚藍(lán)法、紅墨水染色法及其原理不能檢驗(yàn)其活力狀況(Bekendam和Gob1979;Woodstock1973),這一結(jié)果與陳貴林等(2011)所述鎖陽種子生活力的結(jié)論不一致(種胚在強(qiáng)光下用0.5%TTC染色)。本著成本低廉、省時快速、方法簡便,不受休眠限制和結(jié)果準(zhǔn)確的原則