rp-hplc法測(cè)定青海產(chǎn)畫(huà)法中2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-o-d-葡萄糖苷

rp-hplc法測(cè)定青海產(chǎn)畫(huà)法中2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-o--d-葡萄糖苷

七寶美贊粒是2000年版《中國(guó)藥典》收錄的品種。它由七個(gè)香料組成：何首烏、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂（炒苦海）、枸杞（酒蒸發(fā)）、兔蠶絲籽（炒苦海）、椰子（炒）、椰子和牛膝（酒蒸發(fā)）。本品是在明代方士邵應(yīng)節(jié)所傳七寶美髯丹的基礎(chǔ)上,經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)最新工藝提純開(kāi)發(fā)而成的具有滋補(bǔ)肝腎功能的純天然藥物,用于肝腎不足、須發(fā)早白、頭眩耳鳴、腰酸背痛等癥?，F(xiàn)代研究表明:2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為二苯乙烯苷)具有抗衰老、提高免疫、防止動(dòng)脈硬化的功效,在體外對(duì)蛋白激酶C活性有一定的抑制作用。因此,該成分是七寶美髯顆粒中的活性成分之一。為了控制七寶美髯顆粒的質(zhì)量,保證其療效,筆者采用HPLC法測(cè)定了二苯乙烯苷在該制劑中的含量,并對(duì)測(cè)定方法學(xué)進(jìn)行了研究。1儀器和試劑1.1高效色譜柱10成/ldp高效液相色譜儀(日本島津CLASS-VP10AVP),C18—ODS色譜柱(4.6mm×250mm,25μm;大連依利特),HP1050/3D化學(xué)工作站。1.2樣品七寶美髯顆粒,購(gòu)于河南省醫(yī)藥公司,重慶某制藥廠(chǎng)生產(chǎn)。1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)二苯乙烯苷對(duì)照品,批號(hào)0844-200003,供含量測(cè)定用(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。1.4試劑所用試劑均為分析純、色譜純。水為重蒸餾水(自制)。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相2080用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-水(20∶80)為流動(dòng)相;流速1.0ml·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)320nm;理論板數(shù)按二苯乙烯苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。2.2對(duì)照溶液的制備精密稱(chēng)取二苯乙烯苷對(duì)照品適量,加稀乙醇制成每1ml含35μg的溶液,即得。2.3稀乙醇法減失取本品細(xì)粉1g,精密稱(chēng)定,置圓底燒瓶中,精密加入稀乙醇50ml,稱(chēng)定重量,加熱回流30min,放冷,再稱(chēng)定重量,用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,上清液用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。制備方法的考察曾選用甲醇超聲處理30min,稀乙醇超聲處理30min,稀乙醇加熱回流30min,甲醇加熱回流30min,結(jié)果四種方法所得供試液色譜基本一致,10min內(nèi)色譜峰已出完。以稀乙醇加熱回流30min的供試液測(cè)定值最高,故確定以稀乙醇加熱回流30min制備供試液。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖的建立精密稱(chēng)取二苯乙烯苷對(duì)照品4.21mg(批號(hào)0844-200003,供含量測(cè)定用),至25ml量瓶中,加稀乙醇至刻度,搖勻,得0.1684mg/ml的對(duì)照品溶液。精密吸取5ml至25ml量瓶中,加稀乙醇至刻度,搖勻,得33.68μg/ml的對(duì)照品溶液。分別吸取5,10,15,20,25μl,按HPLC條件,進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣量(X)對(duì)峰面積(Y)作圖,得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。其回歸方程Y=2.94×10-7X+0.02748,r=0.99998,n=5。二苯乙烯苷對(duì)照品在在0.1684-0.842μg范圍內(nèi),進(jìn)樣量與峰面積間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。2.5峰面積積分值準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液10.0μl,注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積值,重復(fù)進(jìn)樣6次,二苯乙烯苷峰面積積分值分別為1121619,1142146,1147010,1147771,1156098,1148592,RSD=1.03%,n=6。結(jié)果表明,本法精密度較好。2.6峰面積值的測(cè)定取同一供試品溶液,分別于1,2,3,4,5,6h測(cè)定二苯乙烯苷的峰面積值,結(jié)果:RSD=0.78%,n=6?？芍┰嚻啡芤涸?h內(nèi)穩(wěn)定。2.7rsd測(cè)定對(duì)同一批樣品平行制備5份供試液,分別取10.0μl,注入液相色譜儀,進(jìn)行含量測(cè)定,RSD=1.96%,n=5。表明本法重現(xiàn)性較好。2.8測(cè)定條件及干擾取缺制首烏的處方藥材,按工藝制備制成缺制首烏的陰性制劑,照供試品溶液制備方法制成陰性溶液,分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10.0μl,注入液相色譜儀,按上述條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,從色譜圖中可以看出,方中其它成分在本測(cè)定條件下,對(duì)二苯乙烯苷的含量測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1,圖2,圖3。2.9加樣回收率試驗(yàn)分別取已知含量的樣品5份,精密稱(chēng)定,分別加入二苯乙烯苷對(duì)照品溶液1ml(濃度0.97mg/ml),照供試品溶液的制備方法,分別吸取供試品液各10.0μl,按照上述色譜條件,測(cè)定二苯乙烯苷的含量,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,本測(cè)定方法回收率良好。2.10試驗(yàn)中樣品的含量分別取不同批號(hào)的樣品,按本方法的測(cè)定條件,分別測(cè)定各樣品中二苯乙烯苷的含量,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3.1二苯乙烯苷對(duì)照品的稀乙醇溶液不穩(wěn)定,《中國(guó)藥典》(2000年版一部)何首烏項(xiàng)下二苯乙烯苷的測(cè)定要求避光操作,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)照品溶液放置2d以后含量逐漸降低。因此,定量用二苯乙烯苷對(duì)照品溶液用前現(xiàn)配測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確。3.2制何首烏是七寶美髯顆粒處方中的君藥,二苯乙烯苷是制何首烏的主要活性成分之一,