近紅外光譜快速識別方法的研究

近紅外光譜快速識別方法的研究

中藥龍齒是古代仰光牙齒的化石。隨著其資源的日益減少和價格的提高，其假冒產(chǎn)品也在增加。如:將?；蚱渌溉閯游锏难例X經(jīng)石灰窖埋后,再打碎成細(xì)小碎塊或粉末后充“白龍齒”出售。其外觀性狀與正品大致相同,外觀類似,不易區(qū)別,而以性狀鑒別為基礎(chǔ)的經(jīng)驗鑒別因主觀性較強(qiáng)很難快速準(zhǔn)確鑒別其真?zhèn)?因此探索采用中紅外光譜對真?zhèn)锡堼X進(jìn)行鑒別。近年來,利用近紅外光譜法鑒別中藥材真?zhèn)蔚难芯吭絹碓蕉?而對中藥龍齒真?zhèn)舞b別尚無。筆者嘗試?yán)媒t光譜法對真?zhèn)锡堼X進(jìn)行快速分析研究,并建立相應(yīng)的定性模型,所建立的聚類分析模型可以快速鑒別真?zhèn)锡堼X。1設(shè)備和材料1.1近紅外光譜儀測定Spectrum400傅立葉變換紅外光譜儀,測定范圍:4000~400cm-1,車載近紅外光譜儀(MATRIX-F型,外接1.5m固體光纖探頭),OPUS工作站。1.2樣品的鑒定與鑒定23批樣品分別采自于湖北中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館、安徽亳州中藥材市場、河北安國中藥材市場、河南禹州中藥材市場、湖南廉橋中藥材市場以及湖南花板橋中藥材市場。每批樣品均經(jīng)過湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室陳科力教授鑒定。溴化鉀(KBr)(AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。2方法和結(jié)果2.1磷酸鈣的紅外吸收峰取龍齒原藥材洗凈,晾干,砸成小塊,粉碎過200目篩備用。分別將樣品粉末和磨細(xì)的溴化鉀按1∶100的比例在瑪瑙研缽中混合均勻,在手動壓片機(jī)上制成透明薄片進(jìn)行測試。測定區(qū)域4000~400cm-1,掃描次數(shù)16次,分辨率4cm-1,數(shù)據(jù)處理圖譜經(jīng)計算機(jī)自動基線校正和自動縱坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化處理。對比真?zhèn)锡堼X的紅外吸收圖譜,如圖1,發(fā)現(xiàn)二者有相似之處。由于龍齒的主要成分為碳酸鈣和磷酸鈣,從其紅外吸收光譜可以觀察到磷酸鈣的特征吸收峰1033,957,602,565,470cm-1,其中1033cm-1為PO42-反對稱伸縮振動,957cm-1為PO42-對稱伸縮振動,602、565cm-1為PO42-不對稱變角振動,470cm-1為PO42-對稱變角振動。CO32-的4個原子處于同一平面內(nèi),3個氧原子在正三角形的3個頂點。CO32-有4種振動模式,分別是反對稱伸縮振動、對稱伸縮振動、面外彎曲振動、面內(nèi)彎曲振動。CO32-所對應(yīng)的紅外吸收峰位置分別處于以下4個窄帶之內(nèi):1510~1390cm-1,1120~1045cm-1,885~820cm-1,775~680cm-1。圖1中對應(yīng)的CO32-吸收峰為1452,1423,1033,863,711cm-1,其中CO32-反對稱伸縮振動對應(yīng)1452,1423cm-1雙峰,1033cm-1本該為弱峰,該處有PO42-反對稱伸縮振動的貢獻(xiàn),故為強(qiáng)峰。3443cm-1處為O-H伸縮振動吸收峰,因龍齒中還含有甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等7種氨基酸;1636cm-1可能為酰胺基中的羰基吸收峰。從峰位上看,圖1所示的真?zhèn)锡堼X紅外光譜在峰數(shù)和形狀上幾乎一致,但在820~660cm-1區(qū)域二者的圖譜存在著微小差異,偽品龍齒含有更多的峰信號。結(jié)果表明:在紅外光譜吸收范圍內(nèi),偽品龍齒較正品龍齒含有更多的物質(zhì)信息。2.2近紅外光譜分析2.2.1近紅外掃描法所采集的樣品多來源于國內(nèi)流通量較大的中藥材專業(yè)市場內(nèi)主營礦物類藥材店面,樣品具有一定的地域代表性。對龍齒藥材樣品進(jìn)行光譜采集前應(yīng)該仔細(xì)觀察采集面的物理特征,排除樣品表面可能混有其他無機(jī)雜質(zhì)部位,以免影響樣品蘊(yùn)含的真實光譜信息;其次,龍齒藥材外部棱角分明,在進(jìn)行近紅外掃描時,應(yīng)選擇平整部分,使光纖探頭與樣品貼合緊密,減少光的散射;另外,樣品內(nèi)的化學(xué)成分分布可能不一致,采集光譜時應(yīng)分次對藥材的各個面進(jìn)行掃描,保證樣品數(shù)據(jù)的完整性。同時將藥材粉碎,混合均勻后,對其粉末進(jìn)行光譜采集。光譜采集參數(shù):掃描波數(shù)間隔為8cm-1,掃描累積32次,掃描區(qū)間為12000~4000cm-1,InGaAs檢測器,光纖傳導(dǎo)。每份藥材樣品各面掃描共10次,藥材粉末重復(fù)掃描10次。龍齒原藥材及藥材粉末近紅外圖譜見圖2。由圖2可以看出,龍齒藥材粉末的10張近紅外光譜重合在一起,光譜之間的差異性很小;而龍齒原藥材不同部位掃描得到的10張近紅外光譜各有差異,各個光譜不僅在吸光度上有差別,在峰形上也千差萬別。因此將原藥材不同面采集的圖譜與原藥材粉末的圖譜結(jié)合起來共同建立定性模型,既增大了藥材的信息量,又加強(qiáng)了模型的適用性。2.2.2龍齒樣品預(yù)處理方法確定從23批次樣品中隨機(jī)挑選11批樣品,編號為LQ-004號樣品藥材采集光譜后,將其粉碎制成編號為LQ-004-1號樣品,故訓(xùn)練集樣品共12批次,其余12批次為驗證集樣品。訓(xùn)練集樣品信息見表1,驗證集樣品信息見表2。對上述樣品的光譜圖進(jìn)行仔細(xì)觀察,發(fā)現(xiàn)所有樣品的近紅外光譜整體上較為相似,經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)處理后,光譜差異變得明顯,樣品的近紅外漫反射原始光譜和一階導(dǎo)數(shù)光譜見圖3。從樣品原始圖譜可以觀察到龍齒及其偽品在9000~8000cm-1,7000~5600cm-1,4800~4000cm-13個波長區(qū)域內(nèi)光譜信號稍有不同,光譜經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)處理后,上述區(qū)域光譜差異更加明顯。由于建模樣品涉及到原藥材(塊狀)與藥材粉末,樣品的徑粒對近紅外光譜具有明顯的影響,而矢量歸一化法可以消除徑粒對光譜的影響,因此采用矢量歸一化方法對圖譜進(jìn)行預(yù)處理是必要的。OPUS軟件可以對圖譜進(jìn)行預(yù)處理,通過考察一階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化、二階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化4種預(yù)處理方法進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)利用一階導(dǎo)數(shù)和一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理圖譜進(jìn)行聚類分析可以準(zhǔn)確將真?zhèn)锡堼X區(qū)別開。為了增加模型的適用性,消除樣品徑粒對光譜的影響,我們選擇預(yù)處理方法為:一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化。預(yù)處理方法中還包含有平滑點數(shù)的選擇,平滑可以消除誤差、改進(jìn)數(shù)據(jù),在本模型中選擇5、9、13點平滑均未對聚類分析結(jié)果產(chǎn)生影響,但是平滑點數(shù)過多,會使數(shù)據(jù)失真,所以選擇9點平滑。波段范圍:9000~8000cm-1,7000~5600cm-1,4800~4000cm-1,采用Ward’salgorithm(標(biāo)準(zhǔn)算法)計算,真?zhèn)锡堼X聚類分析圖見圖4。由圖4可以看出,龍齒真品和偽品各聚為一類。在樹狀圖的左支(A)中,LQ-004-1、AG-017、YZ-022、AG-023、HBQ-002和BZD-002號樣品各自的10張光譜最先聚為一類,而其他6批樣品各自的10張光譜聚類較分散,說明龍齒藥材不同部位的化學(xué)成分可能有一定差異,藥材表面物理性質(zhì)的差異也會對光譜產(chǎn)生影響;而藥材粉碎成粉末后,其化學(xué)成分分布較均勻,故光譜的距離較小。另外LQ-004號樣品的10張光譜與其他正品樣品聚類,而與LQ-004-1號樣品聚類的僅有1張光譜,提示藥材經(jīng)過粉碎后其光譜會較原藥材發(fā)生變化,可能是徑粒等物理因素的影響或者是原藥材中的化學(xué)成分重新分布。在樹狀圖的右支(B),LQ-006、BZC-043和ZY-035的圖譜在各小分支中聚集比較緊密,說明實驗的3批龍齒藥材偽品的化學(xué)成分較為接近,可能為同一種摻偽方式。從上述聚類分析圖譜可以明顯觀察到真?zhèn)锡堼X之間的區(qū)別,因此利用近紅外聚類分析法可以快速準(zhǔn)確地鑒別真?zhèn)锡堼X。2.2.3模型識別的結(jié)果將驗證集的11批樣品110張光譜帶入到已建好的真?zhèn)锡堼X定性模型中,對所有圖譜的正確識別率為72%,假陽性率為19%,如果以每一批樣品中的10張圖譜中的6張或以上被正確識別,則認(rèn)為對這一批樣品鑒別正確,那模型的識別率為82%。通過對上述模型的驗證,我們建立的龍齒近紅外定性鑒別模型基本能快速準(zhǔn)確地鑒別真?zhèn)锡堼X。3龍齒真品的鑒定—討論龍齒為古代哺乳動物牙齒的化石,它們早期最原始的形態(tài)是動物的牙齒,牙齒因為有機(jī)質(zhì)較少,無機(jī)質(zhì)較多,故能保存較長的時間。牙齒被泥沙掩埋后地下水將過剩的礦物質(zhì)沉淀下來或成為晶體,隨著水流會逐漸滲進(jìn)泥沙中,填補(bǔ)牙齒有機(jī)質(zhì)腐爛后留下的空間,天長日久,原來的牙齒變成了還保存牙齒原有外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的石頭。而從國內(nèi)大型專業(yè)中藥材市場采集的龍齒偽品,經(jīng)陳科力教授鑒定為大型動物的牙齒,經(jīng)酸腐蝕和土埋處理后,作為龍齒銷售。因此用中紅外光譜法分析真?zhèn)锡堼X時,龍齒偽品含有較多的峰信息,可能為大型動物牙齒中少量的有機(jī)物特征信息。在聚類分析模型中,發(fā)現(xiàn)各批龍齒原藥材的10張近紅外光譜在小類上相互聚集,藥材粉末的10張光譜都能緊緊地聚在一起。同一批龍齒的原藥材光譜只有部分光譜與其粉末的10張光譜聚為一類,可能的原因在于龍齒原藥材表面的化學(xué)成分分布不均勻。如:龍齒表面的琺瑯質(zhì)和龍齒橫斷面,在同一藥材不同面采集的10張近紅外光譜分別包含著相同或不同的化學(xué)信息,因此影響了模型的正確率。另外,各批次間的龍齒正品或龍齒偽品的化學(xué)信息也會有所不同,這也可能影響近紅外聚類分析模型的正確率。近紅外光譜技術(shù)具有快速