基于超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜的蛇膽陳皮口服液抗炎平喘活性成分快速檢測

基于超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜的蛇膽陳皮口服液抗炎平喘活性成分快速檢測

近年來，哮喘的發(fā)病率和死亡率有上升趨勢。世界上約有3億哮喘患者已成為最嚴(yán)重的慢性肺部疾病1%。哮喘通常與特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)有關(guān),由慢性炎癥引起,并導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性增加,喘息、呼吸困難、胸悶和咳嗽的反復(fù)發(fā)作［2］。目前β2腎上腺素受體激動劑(β2-adrenergicreceptor,β2-AR)和NF-κB通路炎癥抑制類藥物是公認(rèn)的治療哮喘的一線藥物,其作用機(jī)制也相對比較清晰［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn),β2-AR與NF-κB抑制劑合用可明顯減輕支氣管哮喘與炎癥的病理癥狀,為治療支氣管哮喘最有效的聯(lián)合用藥的模式［4-5］。根據(jù)中醫(yī)辨證治療原則,中成藥蛇膽陳皮口服液臨床上廣泛用于治療痰熱雍盛所致支氣管哮喘及慢性支氣管炎［6］。復(fù)方中藥藥效成分復(fù)雜且機(jī)制不清一直是困擾中藥現(xiàn)代化及國際化的主要瓶頸之一,闡明中藥的有效成分及作用機(jī)制是解決問題的關(guān)鍵。鑒于中藥在有效成分篩選和藥效評價上的復(fù)雜性及關(guān)聯(lián)性,將現(xiàn)代分析技術(shù)與現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)評價相結(jié)合的譜效捕獲技術(shù)是“中藥譜效學(xué)”發(fā)展的主要手段［7-8］。本課題組將UPLC/Q-TOF-MS超強(qiáng)的分離能力及高分辨質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)解析能力與雙熒光報(bào)告基因高靈敏度且穩(wěn)定的活性評價能力結(jié)合起來,建立了一種快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)且可靠的篩選β2-AR與NF-κB抑制劑的分析方法,只需要通過極其微量的色譜分離即可快速篩選鑒定出復(fù)方中藥中的平喘抗炎活性成分,為復(fù)方中藥及復(fù)雜天然產(chǎn)物中平喘抗炎活性物質(zhì)的研究提供了一種新的分析方法。1儀器、試劑和試藥WatersAcquityTM超高效液相色譜系統(tǒng),配置高真空脫氣泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器、Masslynx色譜工作站(Waters公司,USA);WatersQ-TOFPremier質(zhì)譜儀(WatersMSTechnologies,Man-chester,UK);AcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)色譜柱(Waters公司,USA);Milli-Q超純水儀(Millipore公司,USA);Modulus熒光檢測儀(TurnerDesigns,USA);酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司,USA);CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司,USA)。蛇膽陳皮口服液(江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司);膽酸、甘氨膽酸、牛磺鵝去氧膽酸和?；悄懰?純度大于98%,天津一方科技有限公司);雙抗(氨芐青霉、鏈霉素100×)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM/HIGHGLUCOSE培養(yǎng)基(Gibco公司,USA);二甲基亞砜(DMSO)、轉(zhuǎn)染試劑PEI、選擇性抗生素Zeocin(Invitrogen公司,USA);雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒、質(zhì)粒pGL4.29、質(zhì)粒pGL4.32、質(zhì)粒Renilla(Promega公司,USA);地塞米松、亮氨酸-腦啡肽乙酸鹽(LEA)(Sigma公司,USA);人源TNF-α(PeproTech公司,USA);乙腈為色譜純。1.2體外膜轉(zhuǎn)染及活性驗(yàn)證1.2.1UPLC-Q/TOF樣品制備取蛇膽陳皮口服液100μL,過0.22μm微孔濾膜,進(jìn)行UPLC-Q/TOF分析。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)過量表達(dá)β2AR的人腎胚細(xì)胞(humanembryonickidney293,HEK293)β2AR-293細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。β2AR-293細(xì)胞置于37℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(含有10%FBS和1%雙抗);選用人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B,置于37℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(含有10%FBS和1%雙抗)。1.2.3雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染β2AR-293細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板,待細(xì)胞融合至50%~70%時,用轉(zhuǎn)染試劑PEI將β2AR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL4.29和內(nèi)參熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒Re-nilla共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi),分別加入pGL4.29100ng·孔－1和Renilla16ng·孔－1,轉(zhuǎn)染試劑PEI(1mg·mL－1)與pGL4.29的比例為8∶1,轉(zhuǎn)染24h后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BEAS-2B細(xì)胞共轉(zhuǎn)染方法相同,區(qū)別在于將NF-κB熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL4.32和內(nèi)參熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒Renilla共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi),分別加入pGL4.32100ng·孔－1和Renilla9.6ng·孔－1。有效單體活性驗(yàn)證:設(shè)置空白對照組(Con)、模型組(Mod)、陽性藥地塞米松組(Dex,1×10－6mol·L－1)、蛇膽陳皮口服液組(SDCP,1×10－4mol·L－1)、膽酸組(cholicacid,1×10－4mol·L－1)、牛磺鵝去氧膽酸組(taurochenodeoxycholicacid,1×10－4mol·L－1)、甘氨膽酸組(glycocholicacid,1×10－4mol·L－1)和牛磺膽酸組(taurocholicacid,1×10－4mol·L－1)共8組(n=6)。各組藥物預(yù)孵育細(xì)胞1h后,加入TNF-α5ng·mL－1造模6h,收集細(xì)胞裂解液、細(xì)胞上清液用于NF-κB熒光活性及IL-6、IL-8等炎癥因子的檢測。給藥結(jié)束后,收集各組細(xì)胞上清液,10000r·min－1,4℃離心10min后取上清,用ELISA法檢測IL-6和IL-8的含量變化。1.2.6UPLC條件采用色譜柱WatersAcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm);流速0.4mL·min－1;PDA檢測190~400nm掃描;進(jìn)樣量:1.0μL;柱溫30℃;流動相:A為水,B為乙腈;二元梯度洗脫程序見表1。1.2.7質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI-MS),數(shù)據(jù)采集工作站為MassLynx4.1。正離子模式:離子源溫度110℃;毛細(xì)管電壓3.0kV;樣品cone電壓30V;霧化氣為高純氮?dú)?霧化氣流速600L·h－1,溫度350℃;掃描范圍50~1200,掃描頻率0.1s,掃描間隔延時0.02s;校正液采用亮氨酸腦啡肽(LEA,[M+H]+=555.2931)。負(fù)離子模式:離子源溫度110℃;毛細(xì)管電壓2.5kV;樣品cone電壓45V;霧化氣為高純氮?dú)?霧化氣流速600L·h－1,溫度350℃;掃描范圍50~1200,掃描頻率0.1s,掃描間隔延時0.02s;校正液采用亮氨酸腦啡肽(LEA,[M-H]－=553.2775)。2結(jié)果2.1-ar激活效應(yīng)和nf-b抑制作用檢測取蛇膽陳皮口服液100μL,用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液等比稀釋30、100、300、1000、3000和10000倍,通過建立的雙熒光素酶報(bào)告體系進(jìn)行β2-AR激活效應(yīng)和NF-κB抑制作用的檢測。結(jié)果提示,高濃度組蛇膽陳皮口服液具有明顯β2-AR激活效應(yīng)和顯著的NF-κB活性抑制作用(圖1),故我們進(jìn)一步對蛇膽陳皮口服液進(jìn)行UPLC/Q-TOF-MS分析及活性檢測。2.2蛇膽陳皮口服液的uplc--1和2e-b雙熒光檢測蛇膽陳皮口服液經(jīng)UPLC分離后,通過分流器分流,90%洗脫液收集于深孔板中用于活性檢測,其余10%用于Q-TOF-MS分析,其正離子模式及負(fù)離子模式總離子流圖見圖2。按0.25min·孔－1收集蛇膽陳皮口服液的UPLC流出液,共收集88段,通過β2-AR和NF-κB雙熒光檢測系統(tǒng)檢測每份流出液對β2-AR激活作用和NF-κB抑制作用活性,結(jié)果見圖2D和2E,質(zhì)譜信息見表2,其中11號峰辛弗林對β2-AR激活效應(yīng)明顯;膽酸(6號峰),甘氨膽酸(9號峰),牛磺鵝去氧膽酸(10號峰)和?；悄懰?13號峰)對抑制NF-κB激活作用效應(yīng)明顯,?；蛆Z去氧膽酸和牛磺膽酸對抑制NF-κB激活作用最顯著。2.3林分平滑機(jī)制由于篩選的β2-AR激動劑為辛弗林,在前期的藥理研究中已對辛弗林的平喘機(jī)制進(jìn)行探討。在抗炎成分評價中,蛇膽陳皮口服液篩選出的膽酸、甘氨膽酸、?；蛆Z去氧膽酸和牛磺膽酸等NF-κB抑制劑對炎癥因子IL-6和IL-8表達(dá)的影響(圖3),進(jìn)一步驗(yàn)證其抗炎效果。3蛇膽陳皮口服液在本實(shí)驗(yàn)中,我們從蛇膽陳皮口服液中篩選鑒定出1個平喘成分辛弗林,辛弗林是一個眾所周知的β2-AR激動劑,能擴(kuò)張支氣管平滑肌和血管骨骼肌,已被用于哮喘及鼻充血堵塞的治療,可認(rèn)為是蛇膽陳皮口服液中最主要的緩解支氣管痙攣的成分［9］。在今后的實(shí)驗(yàn)可對方中協(xié)同辛弗林增效的成分進(jìn)行篩選。3.2色譜柱及色譜柱的選擇液相條件對色譜柱(AcquityBEHC18100或50mm)及流動相(甲醇-水或乙腈-水)進(jìn)行了考察,100mm的長柱比短柱有更大的載樣量且峰的分離能力更強(qiáng),流動相選用乙腈有更平穩(wěn)的基線、更好的峰形及信號響應(yīng),所以選取色譜柱為BEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)、流動相為乙腈-水,能更好地表征蛇膽陳皮口服液中主要的色譜峰(圖2);然后對毛細(xì)管電壓、離子源溫度、錐孔氣流量等質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,最后確定錐孔氣流量為50L·h－1,離子源溫度為110℃,毛細(xì)管電壓正離子模式下為3.0kV,負(fù)離子模式下為2.5kV。3.3細(xì)胞產(chǎn)品集中連接共轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞匯合度是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。當(dāng)轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合度>80%共轉(zhuǎn)染效率很低,細(xì)胞匯合度>90%時幾乎無法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,經(jīng)過雙熒光報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測得的數(shù)值非常低,誤差增大,結(jié)果無意義。故共轉(zhuǎn)染前需要留意細(xì)胞匯合度,使匯合度控制在50%~70%時進(jìn)行共轉(zhuǎn)染較好。1.1細(xì)胞活力檢測1.2.4UPLC分段樣品的制備及活性檢測蛇膽陳皮口服液經(jīng)UPLC分離后,流出液用分流器按1∶9體積比進(jìn)行分流,10%直接進(jìn)入質(zhì)譜用于物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息分析;其余90%收集于深孔板(規(guī)格為孔容積2.2mL)中用于NF-κB和β2-AR熒光活性檢測,流出液每隔0.25min收集為1段,收集后置于真空干燥箱中,40℃揮干流動相,殘留物直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基(100μL·孔-1