血清蛋白組學技術(shù)優(yōu)化鼻咽癌腫瘤抗原篩選方法的研究

血清蛋白組學技術(shù)優(yōu)化鼻咽癌腫瘤抗原篩選方法的研究

人類腫瘤特定基因的篩選長期以來是腫瘤免疫學術(shù)界的研究重點。隨著腫瘤免疫理論和研究技術(shù)的發(fā)展，一些方法已用于腫瘤表面檢測。例如，t細胞成像技術(shù)、血清學篩選、血漿透明度檢測、糖質(zhì)示明率顯示等。上述技術(shù)在研究相應的腫瘤相關(guān)抗原中已顯示出一定的效果,但尚存一些不足之處。由于蛋白質(zhì)組學技術(shù)近年來的發(fā)展,從蛋白質(zhì)組水平篩選腫瘤抗原已陳現(xiàn)出其優(yōu)勢。目前,有關(guān)鼻咽癌腫瘤抗原的研究仍然集中于研究EB病毒與鼻咽癌的相互關(guān)系上,而有關(guān)鼻咽癌細胞本身的腫瘤抗原研究到目前為止還幾乎是空白。因此,我們試圖通過應用血清蛋白組學技術(shù)對鼻咽癌腫瘤抗原進行篩選,尋找一種篩選腫瘤抗原的便捷、靈敏的有效方法。1材料和方法1.1試劑與儀器所有的鼻咽癌患者血清均取自四川大學華西醫(yī)院經(jīng)組織活檢、病理切片確診為鼻咽癌的初診患者。正常血清為體檢時所得正常人血清。人高分化鱗狀上皮鼻咽癌細胞系CNE-1由河南醫(yī)科大學惠贈。十二烷基磺酸鈉(SDS)、甘氨酸(Glycine)、Tris、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍G-250、蛋白定量試劑盒為BIO-RAD公司產(chǎn)品;GoatantihumanIgGAP(二抗)購自Sigma公司;磁珠Dynabeads?proteinA購自Dynal公司;顯色劑BCIP/NBTAlkalinePhosphataseSubstrateKitⅣ購自VectorLaboratories公司;硝酸纖維素膜BioTraceNTMembrane購自PALL公司。電泳儀Mini-PROTEIN?3CELL、MiniTransBlot?ElectrophoreticTransferCell、GS-800標準掃描儀、PDQuest凝膠圖像分析軟件均為BIO-RAD公司產(chǎn)品;Biflex質(zhì)譜儀為德國Bruker公司產(chǎn)品。1.2飽和水溶液培養(yǎng)基CNE-1細胞在含有10%小牛血清、100μg/nl青霉素、100μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,于37℃,5%C02飽和濕度的條件下培養(yǎng)。待細胞增殖至對數(shù)生長期時用生理鹽水沖洗3遍,然后在冰浴條件下用細胞刮輕輕刮下,離心,棄上清,余留細胞團充分瀝水后,置-80℃冰箱中保存待用。1.3裂解緩沖液sds將收集的細胞團(約1×107個細胞)重懸于10μl蛋白酶抑制劑Cocktail+1mlRIPA裂解緩沖液(150mmol/LNaCl;1.0%NP40;0.5%脫氧膽酸鈉;0.1%SDS;50mmoI/LTris,pH8.0。使用前4℃預冷)中,并在冰浴條件下對細胞裂解物行超聲裂解6次,每次10s,冰浴30min,15000r/min離心15min,收集上清,于-80℃保存。1.4tween20核心將12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移的硝酸纖維素膜(NC膜)在室溫下用含5%脫脂奶粉的PBS-T(137mmol/LNaCl,2.7mmol/LKCl,10mmol/LNa2HPO4,2mmol/LKH2PO4,0.05%(v/v)Tween20,pH7.4)封閉21h,PBS洗3次,每次5min。將1NC膜按電泳樣品軌跡剪成條狀,分別用不同鼻咽癌患者的血清及正常血清(1:500稀釋)在4℃條件下孵育過夜,PBS洗3次,每次5min,然后加入堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG(二抗,1:30000稀釋)室溫孵育2h后,PBS洗5min,底物生色液顯色。比較篩選出含有特異性抗體的病人血清。1.5抗體產(chǎn)物的制備取0.5ml細胞裂解液移入EP管中,加入篩選出來的鼻咽癌血清2μl,室溫下于搖床上孵育2h。向EP管中各加入DynabeadsproteinA100μl,充分混勻,室溫輕輕振蕩孵育15min。用0.1mol/LNa-phosphate(pH8.1)0.5ml反復清洗3次,然后用0.1mol/Lcitrate(pH3.1)30μl洗脫抗原-抗體復合物,共2次。在洗脫樣品中加入2×SDS凝膠加樣緩沖液,樣品置沸水中3～5min,15000r/min,離心5min。正常對照血清處理同上。將制備好的樣品進行1-DSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染,篩選差異條帶。1.6蛋白質(zhì)鑒定和數(shù)據(jù)庫更新+和Monoisotopic,半胱氨酸為脲甲基半胱氨酸,被選擇的片段信號峰均應較強,為基線寬度的1倍以上。2結(jié)果2.1免疫反應性實驗經(jīng)Westernblot比較正常血清與鼻咽癌患者血清以及不同鼻咽癌血清之間的免疫反應性差異,找出含有特異性抗體的鼻咽癌患者血清(圖1)。實驗重復3次,重復性好。8號血清有明顯區(qū)別與其它血清的反應性條帶存在,表明8號血清中有特異性抗體存在。2.2麻黃小鼠種類型用篩選出來的血清捕捉鼻咽癌腫瘤抗原,經(jīng)免疫沉淀富集(圖2)。如圖所示,箭頭所指處(～68kD)出現(xiàn)特異性差異條帶。另外,其余幾條表現(xiàn)出量的差異,而在～26kD處和～50kD處出現(xiàn)的無差異條帶為免疫球蛋白的重鏈及輕鏈。2.3降解峰校正方法所得蛋白條帶采用Biflex(Bruker公司)進行肽質(zhì)量指紋測定,獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜以酶自動降解峰進行校正,圖3為差異蛋白條帶的肽質(zhì)量指紋圖譜。對所獲得的肽質(zhì)量指紋圖用Expasy中的PeptIdent查詢軟件搜索NCBI/EBI蛋白數(shù)據(jù)庫,結(jié)合SDS凝膠電泳條帶的分子量、匹配肽段的多少(4個片段以上)和覆蓋率(15%)等進行綜合分析,確定該蛋白條帶為膜結(jié)合IgM。3sex-4期2002年7月之后篩選和鑒定新的腫瘤抗原對于尋找新的抗腫瘤疫苗、發(fā)現(xiàn)腫瘤早期診斷和判斷預后的腫瘤標志等具有重要意義。篩選和鑒定抗體識別的腫瘤抗原正成為研究熱點。目前,篩選抗體識別的腫瘤抗原的方法有血清學篩選重組cDNA表達文庫(SEREX)、噬菌體展示技術(shù)(phagedisplay)、核糖體展示技術(shù)、肽庫技術(shù)和蛋白質(zhì)組學技術(shù)。T細胞克隆技術(shù)篩選腫瘤抗原,但該技術(shù)需要建立穩(wěn)定的T細胞系和腫瘤細胞系的,而這種情況通常是難以遇到的,且對某些腫瘤類型來說又是不能做到的。噬菌體展示技術(shù)和核糖體展示技術(shù)需要構(gòu)建和篩選抗體、抗體片段、單鏈抗體等各種類型的抗體庫,從中篩選目的抗體分子,再進一步用來篩選目的抗原。肽庫(peptidlibrary)技術(shù)也需先構(gòu)建一個自然或多肽的肽庫,結(jié)合免疫篩選、肽推論和序列排列分析,然后從中挑出具有抗原性的肽。上述技術(shù)存在操作繁瑣,假陽性結(jié)果較高等問題。SEREX是二十世紀九十年代中期才出現(xiàn)的新技術(shù),它通過用自體或同種異體血清篩選來源于人體腫瘤組織的cDNA表達文庫,以鑒定在不同腫瘤患者免疫產(chǎn)生的自身抗原。但SEREX技術(shù)尚需要解決的問題下列問題:(1)首先應該去除人血清中能與細菌或噬菌體成分發(fā)生反應的抗體。(2)腫瘤中存在各種B細胞產(chǎn)生的IgGmRNA,它們在SEREX中能被表達和檢測,因此,需要尋找去除這些克隆的策略和方法。腫瘤血清蛋白組學是應用腫瘤免疫學和蛋白組學相結(jié)合的方法尋找腫瘤抗原。目前最常用的就是應用2-DPAGE分離腫瘤組織蛋白和癌旁正常組織蛋白,經(jīng)比較二維凝膠的蛋白分布,找出差異蛋白,通過質(zhì)譜鑒定和生物信息學分析,篩選出腫瘤相關(guān)抗原。我們本次實驗在此基礎(chǔ)上做了兩點改進。首先,應用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)篩選具有特異免疫反應性的鼻咽癌患者血清。腫瘤患者免疫水平較正常人為低,不能對腫瘤形成有效的識別及清除。但由于個體差異的影響,每個腫瘤患者對于腫瘤的免疫反應性也有所不同,因此在免疫水平較高的患者血清中就有可能存在針對腫瘤產(chǎn)生的特異性抗體,用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)先篩選出這種血清,再利用血清中含有的特異性抗體篩選出特異性的腫瘤抗原,可提高識別抗原的成功率。我們對所收集的34例鼻咽癌血清進行了蛋白質(zhì)印跡分析,其中8號及23號血清在相同位置出現(xiàn)了不同于其它血清樣品的差異性反應條帶,提示在這2個血清中可能存在鼻咽癌特異性抗體。另外有3個血清樣品存在不同的差異性條帶,應該為個體差異性的表現(xiàn)。其次,通過免疫沉淀技術(shù)富集腫瘤抗原。由于絕大多數(shù)腫瘤抗原在人體內(nèi)的含量都非常少,所以不易被常規(guī)手段檢出。而