玉米肽對乙醇后小鼠的抗氧化性保護作用

玉米肽對乙醇后小鼠的抗氧化性保護作用

酒精中毒是世界上的一種嚴重損害，包括酒精性肝臟損傷和其他并發(fā)癥。目前采用合成方法研制解酒藥物的進展艱難,關(guān)于天然產(chǎn)物醒酒作用的研究愈來愈受到關(guān)注。正常情況下,進入人體內(nèi)的乙醇90%以上是在脫氫酶系統(tǒng)——乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶的催化作用下完成代謝的,肝臟中ADH活力水平是人體乙醇代謝的關(guān)鍵。Sakai等報道了銀杏、茯苓等16種植物藥的水煎液均可降低服用乙醇大鼠的血醇含量,且作用機制均與提高肝臟ADH活性有關(guān)。蛋白肽類的醒酒機制被認為是因為通過提高血液中某些特定氨基酸的濃度,產(chǎn)生穩(wěn)定的輔酶NAD+,維持正常的三羧酸循環(huán)活動。20世紀(jì)90年代后期,Yamaguchi等率先報道了玉米肽(cornprptides,CP)具有促進乙醇代謝的醒酒作用,認為玉米肽的醒酒作用源于其可顯著提高血清中丙氨酸、亮氨酸的濃度,有助于產(chǎn)生穩(wěn)定的輔酶NAD+,以降低血液中乙醇的濃度。此后關(guān)于玉米肽醒酒機理的研究鮮見報道。筆者實驗室近年來對玉米肽的醒酒保肝活性進行了較系統(tǒng)地研究,隋玉杰等曾比較了中性蛋白酶和堿性蛋白酶制備的玉米肽的醒酒活性,發(fā)現(xiàn)玉米肽在體外實驗中能激活A(yù)DH。本研究通過動物實驗,考察雙酶法制備的玉米肽對小鼠酒后血液中乙醇濃度及肝臟中ADH活力的影響,并結(jié)合氨基酸分析對玉米肽的醒酒機理進行進一步探討,旨在揭示玉米肽的醒酒機理,為玉米肽的醒酒產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。1材料和方法1.1實驗動物昆明種小鼠,體質(zhì)量(20±2)g,雄性,購自湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心。1.2免疫活性化合物nad+玉米黃粉(粗蛋白含量為57.31%)正大集團武漢分公司;濃縮玉米蛋白(粗蛋白含量為93.14%)自制。Neutrase中性蛋白酶(100U/mg)、Alcalase堿性蛋白酶(200U/mg)丹麥Novo公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化型輔酶I:日本進口試劑,國內(nèi)分裝;無水乙醇(國產(chǎn)優(yōu)級純);DA201-C大孔樹脂江蘇蘇青水處理工程集團有限公司。1.3光度計和色譜分析UV-102-02FW紫外-可見分光光度計日本島津公司;6890N氣相色譜儀美國Agilent公司;835-50型氨基酸分析儀日本Hitachi公司。1.4方法1.4.1內(nèi)酰胺酶解法alcarlo-酶解法將濃縮玉米蛋白按1:25(m/V)加水,90℃水浴預(yù)處理30min,冷卻后,在溫度為50℃、pH7.3、酶底比1.5%條件下用Neutrase酶解2h;然后調(diào)整溫度為60℃、pH8.0、酶底比1.0%,加入Alcalase酶解4h,100℃水浴保溫10min滅酶,過濾收集濾液,濃縮,凍干后備用。經(jīng)凱氏定氮法測定知玉米肽含量為91.55%。1.4.2玉米肽組的制備將10mg/mL玉米肽溶液,以2.0mL/min的流速上樣過DA201-C大孔樹脂柱,吸附結(jié)束后蒸餾水洗柱2h,之后用15%、50%、85%的乙醇洗脫液連續(xù)洗脫,收集各洗脫液,濃縮蒸發(fā)除去乙醇,冷凍干燥后得到不同體積分數(shù)乙醇洗脫的玉米肽組分。1.4.3肝adh活力測定取出小鼠肝臟后用冷生理鹽水沖洗,然后用蔗糖緩沖液配成10g/100mL的肝勻漿,3000r/min冷凍離心10min,取上清液冷藏,用于ADH活力的測定。1.4.4小鼠肝a、c、dh、aADH在有NAD+存在的弱堿性范圍內(nèi),催化乙醇的脫氫反應(yīng)生成乙醛:同時NAD+被還原成NADH(還原型輔酶Ⅰ)。NADH在波長340nm處有一強吸收峰,通過測定340nm波長處NADH的吸光度每分鐘的變化值,來衡量ADH的活力,吸光度的變化率越大,說明ADH活力越高。測定管中加入pH8.8的焦磷酸鈉緩沖液1.5mL、27mmol/LNAD+1.0mL、體積分數(shù)11.5%乙醇溶液0.5mL混合,于25℃水浴中溫育5min后,立即加入小鼠肝勻漿上清液0.1mL,搖勻后于340nm波長處測定各管的吸光度,計算其5min內(nèi)每分鐘變化率ΔA。ADH的活力(U)以NADH每分鐘生成的微摩爾數(shù)(μmol/min)表示。式中:E為NADH在340nm處的摩爾消光系數(shù),E=6.22×103L/(mol·cm);l為比色杯厚度/cm;3.1為反應(yīng)液總體積/mL;0.1為加入反應(yīng)體系的ADH提取液體積/mL;m為肝質(zhì)量/g;V為勻漿體積/mL。1.4.5溫度生物特性GC測定條件:FID檢測器,T=280℃;DL-Wax毛細管色譜柱:50m×320mm,25μm;H2流速:30mL/min,Air流速:400mL/min,N2流速:30mL/min;柱溫為程序升溫:起始溫度為40℃,保持2min,以25℃/min升至100℃,再保持1min;正丁醇(4μL/mL)作內(nèi)標(biāo)。1.4.6去血蛋白和去肝以及血醇濃度檢測將50只體質(zhì)量為(20±2)g的昆明種雄性小鼠隨機分成玉米肽高、中、低劑量組,空白組,模型組,每組10只。低、中、高CP劑量組分別灌胃CP150、300、600mg/kg,空白組、模型組灌胃等量生理鹽水;30min后,CP組、模型組分別灌胃50%乙醇(分析純)12mL/kg,空白組給予等量生理鹽水,給乙醇1h后分別摘眼球取血和取小鼠肝組織。血液離心后取血清,加入等體積10%三氯乙酸(TCA)和4μL/mL的正丁醇(作內(nèi)標(biāo)),再次離心后取上清液,供測定血醇濃度用;肝組織制成肝勻漿后,供ADH活力測定用。1.4.7灌胃cp0模型小鼠血醇、肝組織活力檢測將60只體質(zhì)量為(20±2)g的昆明種雄性小鼠隨機分為給肽組和乙醇模型組,每組30只。給肽組灌胃CP400mg/kg,模型組灌胃等量生理鹽水,30min后,兩組均灌胃50%乙醇12mL/kg,在灌乙醇后20、50、80、120、160、200min后分別取出5只小鼠,迅速摘眼球取血和肝組織,小鼠血液、肝組織處理及其血醇含量、ADH活力的測定方法如前所述。1.4.8氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷运蜆又梁笔∞r(nóng)業(yè)科學(xué)院測試中心,采用鹽酸水解法、氨基酸自動分析儀進行測定。計算玉米肽平均疏水性Q值。計算公式如下:式中:AAi為100g蛋白質(zhì)中每種氨基酸的含量/g;Mi為各種氨基酸的摩爾質(zhì)量/(g/mol);Δfti為氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷灾?(kJ/mol);∑AAi/Mi為100g蛋白質(zhì)中氨基酸的總物質(zhì)的量/mol;Q為蛋白質(zhì)疏水性值/(kJ/mol)。1.4.9玉米醇對c的抑制率的影響采用脫氧核糖-鐵體系法測定玉米肽對·OH的抑制率。1.4.10.統(tǒng)計分析采用SASV8統(tǒng)計軟件,所有的數(shù)據(jù)組間t檢驗,對實驗結(jié)果進行顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1不同劑量cp對小鼠血清中乙醇含量的影響如圖1所示,與模型組比較,隨著灌胃CP劑量的增加,小鼠血清中乙醇含量不斷降低,當(dāng)CP的劑量為150mg/kg時,小鼠血清中乙醇含量降低未達顯著水平,但當(dāng)CP的劑量為300mg/kg時,血醇含量顯著降低(P<0.05),當(dāng)CP的劑量為600mg/kg時,血醇含量降低達到極顯著水平(P<0.01),乙醇含量降低率達到31.6%;玉米肽的劑量與血醇含量的降低呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。2.2乙醇對小鼠血清中乙醇含量的影響如圖2所示,模型組在灌胃乙醇50min時,血醇含量達最大值,此后逐漸降低。灌胃400mg/kgCP對攝入乙醇后不同時間時小鼠血清中乙醇含量均有降低作用。與乙醇模型組相比,在灌乙醇后20min和120min處,給肽組的乙醇含量降低達顯著水平(P<0.05),而在灌乙醇后50min和80min時,給肽組的乙醇含量降低達到極顯著水平(P<0.01)。此后,兩者的差異逐漸縮小,說明CP對降低血醇含量具有良好的持續(xù)性。2.3米肽對小鼠肝臟adh活力的影響小鼠肝臟ADH的活性直接影響乙醇在肝中的代謝過程,該酶活性降低可使乙醇的生物利用度提高,進而加重乙醇對肝臟、腦等器官的危害作用。如圖3所示,玉米肽對小鼠肝臟中ADH有激活作用。乙醇模型組ADH活力與空白組比較有所降低。與模型組比較,灌胃150mg/kgCP時,不僅能抵消因灌胃乙醇引起的ADH活力降低,并且ADH的活力比空白組更高,灌胃300mg/kgCP可顯著提高小鼠ADH活力(P<0.05),而灌胃600mg/kgCP對小鼠ADH的激活作用達到極顯著水平(P<0.01),ADH激活率高達30.1%;說明灌胃玉米肽與小鼠肝臟ADH活力間存在明顯的量效關(guān)系。2.4小鼠adh活力如圖4所示,給肽組ADH活力均高于乙醇模型組,在小鼠灌乙醇20~80min時間段內(nèi),給肽組和模型組ADH活力均有一定程度的提高,此后小鼠ADH活力逐漸下降。在灌胃乙醇50、80、120min時,給肽組ADH活力顯著高于模型組ADH活力(P<0.05),由此說明玉米肽對小鼠肝臟中ADH活性不僅有較好的激活作用,而且還有良好的持續(xù)激活作用。2.5酒精質(zhì)量及各組分內(nèi)ala、leu、pa的含量用不同體積分數(shù)乙醇從大孔吸附樹脂上進行梯度洗脫玉米肽,分別收集得到3個組分,表1為各組分氨基酸分析結(jié)果,隨著洗脫劑乙醇含量的提高,其中Pro、Arg、Ile、His、Gly、Phe質(zhì)量百分比含量有明顯升高,但Ala含量有所降低。Ala、Leu含量較高,尤其是Leu含量高,有利于醒酒;此外,Pro、Arg對酒精代謝亦有正面作用。組分1(15%乙醇洗脫組)中Ala含量高于組分3(85%乙醇洗脫組);而組分3中Leu含量高于組分1。對于醒酒活性而言,Leu比Ala更重要。如表2所示,隨著洗脫液乙醇含量增大,洗脫組分的疏水性氨基酸所占比例明顯增大,如Pro等。疏水性Q值從組分1的4.95kJ/mol遞增到組分3的6.57kJ/mol。2.6玉米肽對oh的抑制作用不同組分玉米肽具有不同的疏水性,由表3可知,隨洗脫組分疏水性的增加,玉米肽·OH抑制率活性得到提高,85%乙醇洗脫下的CP組分比15%乙醇洗脫組分的CP組分·OH抑制率提高了11.33%。本實驗室以前的研究表明:玉米肽對·OH抑制活性與醒酒活性具有一定的正相關(guān)關(guān)系,提示疏水性Q值最大的組分3其醒酒活性可能最高。如前所述,組分3的Leu含量亦是最高的。Haseba等曾報道了19種短鏈的疏水性物質(zhì)能提高小鼠ADH的活性,促進乙醇代謝。3玉米肽對小鼠肝臟adh活性的影響人體攝入乙醇后,經(jīng)過胃腸道吸收代謝,90%左右的乙醇在肝臟中代謝,ADH在乙醇代謝中起著十分重要的作用,長期大量飲酒易引起脂肪肝、肝炎等肝臟疾病等。哺乳動物有3種ADH同工酶,包括ADH1、ADH2和ADH3,其中ADH1被認為是與乙醇代謝最相關(guān)的酶,它在乙醇代謝中起主要作用,此外有研究發(fā)現(xiàn)ADH3亦對乙醇代謝起重要作用。實驗表明,玉米肽能夠激活小鼠肝臟中ADH的活性,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。乙醇模型組的ADH活力在給酒后20~80min內(nèi)隨著時間延長活性亦不斷提高,這可能與乙醇底物能激活A(yù)DH有關(guān),而給玉米肽組ADH活力在20~200min內(nèi)均高于模型組,說明玉米肽可進一步激活肝臟ADH,促進乙醇的代謝。Haseba等發(fā)現(xiàn)有19種短鏈的疏水性物質(zhì),如丁酰胺、戊酰胺等能提高小鼠ADH3氧化乙醇的活性,而不是作為ADH3的底物。本研究采用雙酶法制備的玉米肽其氨基酸