靈芝三組分gle的抗腫瘤作用研究

靈芝三組分gle的抗腫瘤作用研究

靈芝是多孔科植物的一個總稱。這是中國傳統(tǒng)的補藥方法，具有糾正和鞏固基礎、延長壽命的功效。試驗研究表明,靈芝及其提取物具有抗腫瘤、抗血栓及免疫調(diào)節(jié)等作用。靈芝三萜組分GLE是福建醫(yī)科大學新藥研究所從靈芝中分離得到的一種提取物,主要含靈芝三萜類成分。前期的研究結果顯示GLE對小鼠肝癌H22及人白血病細胞株K562,HL60的生長有較強的抑制作用。為進一步評價靈芝三萜組分GLE的抗腫瘤作用,本研究觀察了GLE體外對人鼻咽癌細胞生長的影響以及體內(nèi)對小鼠S180實體瘤的抑瘤率和腹水瘤的生命延長率的影響。材料表面1分散體的制備靈芝由福建仙芝樓生物科技有限公司提供,經(jīng)福建醫(yī)科大學藥學院天然藥物學系生藥學教研室石冬梅講師鑒定為靈芝[Ganodermalucidum(Leys.eFr.)Karst]的干燥子實體;靈芝三萜組分GLE(福建醫(yī)科大學新藥研究所提供,1g相當于原生藥93g,香草醛-高氯酸比色法測定靈芝三萜含量為56.7%)用泊洛沙姆188制備成固體分散體,質(zhì)量濃度分別為6.25,12.5和25g·L-1,4℃保存?zhèn)溆谩－h(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX,江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國Sigm公司);二甲基亞砜(DMSO,中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);小牛血清(杭州江濱生物技術有限公司);泊洛沙姆188(F68,德國BASF公司);生理鹽水(福州海王福藥制藥有限公司)。2酶標儀和高速離心檢測HERAcell150iCO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);VarioskanFlash3001酶標儀(美國Bio-Rad公司);J221低溫高速離心機(美國Beckman公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);AB204E電子分析天平(瑞士MettlerToledo公司)。3細胞培養(yǎng)和轉染人鼻咽癌高分化細胞CNE1和人鼻咽癌低分化細胞CNE2由福州腫瘤醫(yī)院惠贈,由福建醫(yī)科大學藥學院臨床藥理所保存,CNE1和CNE2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100IU·mL-1和鏈霉素100mg·L-1的RPMI1640培養(yǎng)液中,置37℃,5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于試驗。小鼠S180肉瘤細胞由福建醫(yī)科大學臨床藥理研究所傳代維持。4動物許可證:scx1普通級昆明種小鼠由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXX(閩)20120001,體重18~22g,雌雄各半,按體重隨機分組,分籠飼養(yǎng),自由飲水和進食。方法和結果1處理數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。試驗結果以表示,統(tǒng)計學處理采用組間t檢驗。P<0.05為差異呈顯著性。2gle對cne1細胞增殖的抑制作用按文獻方法,取對數(shù)生長期的CNE1及CNE2細胞,以每毫升4×104個的初始濃度分別接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔190μL,試驗組每孔加入不同濃度藥物10μL(使終質(zhì)量濃度分別為6.25,12.5,25,50,100mg·L-1),對照組加含等濃度DMSO的無血清培養(yǎng)液,空白對照組為190μLRPMI1640加10μL無藥溶劑,每組3個復孔。CNE1及CNE2細胞分別孵育0,24,48,72h后,每孔加入5g·L-1的MTT20μL,37℃孵育4h后,小心吸去上清,每孔加150μLDMSO混勻,各組均于570nm波長處測定各孔的吸光度(A)值,計算細胞生長抑制率,抑制率/%=(1-藥物處理孔平均A值/細胞對照孔平均A值)×100。以藥物濃度(C)為橫軸,抑制率值為縱軸繪制細胞增殖抑制量效關系曲線;以作用時間(t)為橫軸,抑制率值為縱軸繪制細胞增殖抑制時效關系曲線。試驗結果顯示,GLE對CNE1細胞增殖抑制作用較弱(見圖1),但對CNE2細胞增殖有一定的抑制作用,表現(xiàn)出明顯的量效關系和時效關系。藥物作用于CNE2細胞24h無抑制活性,作用48和72h的IC50值分別是26.2和15.8mg·L-1,見圖2。3gle對小鼠生長和瘤重的影響按常規(guī)方法接種腫瘤細胞:取腹腔傳代6~8d生長良好的乳白色腹水,用生理鹽水稀釋至每毫升1×107個。取55只小鼠,雌雄各半,在小鼠右前肢腋下皮下注射接種0.2mL腫瘤細胞懸液,制成實體瘤實驗動物模型。接種次日稱量,小鼠隨機分為陰性對照組(灌胃給予等體積生理鹽水),陽性對照組(灌胃給予CTX30mg·kg-1,3d給藥1次),GLE低、中、高劑量組(分別灌胃給予GLE125,250,500mg·kg-1,連續(xù)7d,qd)。末次給藥24h后稱重,頸椎脫臼處死動物。剝離腫瘤組織,用濾紙吸干后稱瘤重,計算抑瘤率。抑瘤率/%=(1-試驗組瘤重/陰性對照組瘤重)×100。結果表明,與陰性對照組比較,低、中、高劑量GLE均顯著抑制S180實體瘤的生長(P<0.05),且隨著GLE劑量增加,抑瘤率逐漸增加,表明GLE的抑瘤效果具有劑量效應關系。GLE對小鼠S180瘤重的影響,GLE對小鼠S180瘤重的影響見表1。4gle對小鼠生命延長的影響取腹腔傳代6~8d生長良好的乳白色腹水,立即置于無菌管中,以注射用生理鹽水按1∶4比例稀釋成瘤細胞懸液,并計數(shù)調(diào)整活瘤細胞濃度為每毫升6×106個。取50只小鼠,雌雄各半,每只小鼠腹腔注射0.2mL,接種次日稱量,小鼠隨機分為陰性對照組(灌胃給予等體積生理鹽水)、陽性對照組(灌胃給予CTX30mg·kg-1,3d給藥1次),GLE低、中、高劑量組(分別灌胃給予GLE125,250,500mg·kg-1,連續(xù)10d,qd)。停藥后觀察并記錄動物死亡時間,計算生命延長率。生命延長率/%=(1-試驗組平均生存時間/陰性對照組平均生存時間)×100。結果表明,與陰性對照組比較,GLE3個劑量組對S180腹水瘤小鼠生命均具有延長作用,且以GLE高、中劑量組生命延長率較為顯著(P<0.05),見表2。gle的以“三類成分”為主及在聯(lián)合治療本研究結果顯示,CTX陽性對照組雖然有明顯的抑瘤作用,但小鼠在服藥過程中體重增加減少,皮毛不好;GLE高劑量組與陽性對照組抑瘤率接近,且沒有CTX所致的不良反應,提示口服GLE的毒副作用較小。腫瘤治療目前大多采用放化療方法,但化療藥物在治療疾病的同時,對機體正常組織細胞也會產(chǎn)生強烈的殺傷作用。中藥由于毒副作用小,在腫瘤的治療中發(fā)揮出越來越重要的作用。GLE為中藥靈芝提取物,經(jīng)理化分析確定主要含有靈芝三萜類成分。靈芝三萜類成分是靈芝藥用功效的主要活性成分之一,具有廣泛的藥理活性。本試驗發(fā)現(xiàn),GLE在體外對CNE1細胞的增殖抑制作用較弱,而對低分化細胞CNE2細胞增殖有一定的抑制作用,其作用機制還有待進一步研究;在體內(nèi),采用不同劑量GLE干預后,小鼠瘤重在試驗結束時均低于陰性對照組(P<0.05),且抑瘤率均高于中藥療效評價中規(guī)定的指標(抑瘤率30%以上)。其中GLE高、中劑量組對S180肉瘤腹水瘤小鼠生存時間作用