福建省瓜類作物枯萎病菌的is序列分析

福建省瓜類作物枯萎病菌的is序列分析

0形態(tài)特征、生理生化指標、致病性測定[研究意義]作物枯萎是由含有生殖器官菌的加工引起的，這是瓜類作物生產(chǎn)中的主要疾病之一。由于致病性鐮孢菌菌株存在形態(tài)、生理、病理等的多態(tài)性和復雜性，因此，對枯萎病病原菌進行分類鑒定及其差異性分析具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)的病原真菌的分類和鑒定主要基于形態(tài)特征、生理生化指標、致病性測定等，如黃仲生根據(jù)黃瓜枯萎病病原菌的形態(tài)特征和致病性測定，確定黃瓜枯萎病致病菌為尖孢鐮孢黃瓜?；?。任海英等通過對分離菌株的培養(yǎng)性狀、孢子形態(tài)等生物學性狀觀察，確定蠶豆枯萎病病原菌主要是尖鐮孢、木賊鐮孢、串珠鐮孢和燕麥鐮孢。但由于真菌種類多、分布廣、形態(tài)特征復雜，對未知菌株進行準確鑒定往往是專業(yè)真菌學家的工作。另外，由于真菌的形態(tài)特征和生理生化指標易隨環(huán)境條件的變化而表現(xiàn)不穩(wěn)定。因此，傳統(tǒng)的真菌分類和鑒定方法常使人們產(chǎn)生意見分歧?！颈狙芯壳腥朦c】基于傳統(tǒng)的病原真菌分類和鑒定的局限性，克隆和測序真菌核糖體基因，根據(jù)其基因序列的差異進行真菌菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究已成為植物病原學的研究熱點。【擬解決關鍵問題】本研究是在傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定基礎上，利用核糖體DNA-ITS區(qū)序列來輔助鑒定不同瓜類寄主作物上分離的枯萎病菌類型及種群劃分。1材料和方法1.1形態(tài)鑒定鑒定26株分離自不同瓜類寄主作物（黃瓜、甜瓜、西瓜和瓠瓜）的單孢菌株，經(jīng)培養(yǎng)菌落、分生孢子、分生孢子梗、厚垣孢子等的形態(tài)特征觀察，初步鑒定為尖孢鐮孢（Fusariumoxysporum）和串珠鐮孢（Fusariummoniliforme），其中部分菌株為前期試驗中已經(jīng)鑒定的?；停ū?）。1.2聚合酶及生化試劑DNA膠回收純化試劑盒、高保真TaqplusⅠDNA聚合酶均購自杭州博日科技有限公司，100bpplusDNAladder及其它生化試劑購自上海生工生物工程有限公司或為國產(chǎn)分析純試劑。1.3atcg-3CTAB法提取菌株DNA，引物根據(jù)文獻設計合成，正向引物：5′-CTTGCGTTGATTACGTCCC-3′，反向引物：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應的總體積為25μl，含有1個單位的Taq酶、10×buffer2.5μl、dNTP0.2μl、10μmol·L-1的正向引物和反向引物各1μl、DNA模板25ng。PCR擴增程序：94℃預變性10min,94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min，共25個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切出目的片段，經(jīng)純化后送往上海生工生物工程技術服務有限公司和上海英駿生物技術有限公司進行PCR產(chǎn)物雙向直接測序。1.4同源序列比對及聚類分析測序結果中每個樣品的雙向序列用DNAstar軟件中SeqMan進行拼接并輸出全序列，將獲得的序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對分析，用DNAMANversion5.2.2.0軟件對26個菌株的序列進行多重比較及聚類分析。2結果與分析2.12.5細菌的形態(tài)描述2.1.1大型分生孢子患者菌株在PSA平板上，25℃下培養(yǎng)10d后，氣生菌絲體為白色棉絮狀，稀疏或濃密；菌落背面呈白色、淺粉色，或紫色。小型分生孢子長橢圓形或紡錘形，無色透明，0～1隔，少數(shù)2個隔膜，大小10.4(2.6～19.5）×3.0(2.0～3.9）μm；大型分生孢子鐮刀型或紡錘型，稍彎，足胞明顯，1～4個隔膜，多為3個隔膜，大小29.9(15.6～49.4）×3.4(2.3～5.2）μm（圖1-a）；厚垣孢子頂生或串生，圓形或長圓形，12.1(6.5～26.0）μm×7.9(5.2～11.7）μm（圖1-b）；產(chǎn)孢細胞短，單瓶梗（圖1-c）。2.1.2大型分生孢子患者的駁岸結構菌株在PSA平板上，25℃下培養(yǎng)10d后，氣生菌絲體絨狀至粉狀，稀疏或濃密；菌落背面呈白色、米黃色，或紫色。小型分生孢子長橢圓形或紡錘形，無色透明，0～1隔，大小7.3(2.0～10.5）μm×3.0(1.3～4.5）μm；大型分生孢子鐮刀型或紡錘型，較直細，足胞不明顯，1～5個隔膜，其中3個隔膜的居多，大小為33.8(28.6～39.0）μm×3.3(2.6～5.5）μm（圖2-a）；厚垣孢子有或無，頂生或串生，圓形或長圓形，9.9(6.5～13.0）μm×9.6(5.2～13.0）μm（圖2-b）；產(chǎn)孢細胞為單瓶?；驈推抗＃▓D2-c）。2.2鐮孢菌擴增結果供試的鐮孢菌菌株的核糖體DNAITS區(qū)擴增結果如圖3所示，26株不同寄主、不同?；图安煌虏×Φ溺犳呔甓紨U增出單一條帶，大小為700～800bp。2.3菌株核苷酸序列及序列分析序列測定結果顯示，序列長度為676～691bp不等，序列中包含部分18SrRNA、ITS1、5.8SrRNA、ITS2及部份28SrRNA，所獲得的26個菌株的核苷酸序列均已在GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊，序列號為EU364842～364867。2.4f-t.1.3細胞培養(yǎng)菌株的篩選將所得序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索。根據(jù)RenskeLandeweert等對真菌的分子分類原則：即認為通過ITS區(qū)域比對，序列相似性≥99%，鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬；序列相似性≤95%，鑒別為相同科。菌株F-H.6.5-030318-02、F-H.6.5-030318-01、F-T.1.7-030514-12、F-T.1.7-030514-21、F-T.1.7-030514-31、F-T2.1.1-030616-01、F-T2.1.1-030616-15、F-X.1.7-030520-03、F-X.1.7-030520-12、F-X.1.7-030520-13、F-X.1.7-030527-11、F-X.1.7-030527-12、F-T.1.7-040427-1、F-G.1.5-031017-01與尖孢鐮孢（F.oxysporum）的同源性最高，達99%以上，推定這些菌株為尖孢鐮孢；菌株Fm-H.6.5-030318-04、Fm-H.6.5-030318-12、FmH.6.5-030318-13、Fm-H.6.5-030318-11、Fm-T.1.7-030520、Fm-X.1.7-030520-02、Fm-X.1.7-030520-11、Fm-X.1.7-030527-02、Fm-X.1.7-030527-31、Fm-X.1.7-030527-08、Fm-T.1.7-040427-3、Fm-G.1.5-031017-05與串珠鐮孢（F.moniliforme）的同源性最高，達99%以上，推定這些菌株為串珠鐮孢。2.5f-h.5-表2用DNAMANversion5.2.2.0軟件對這26株鐮孢菌的ITS區(qū)序列（包括ITS1、5.8S、ITS2）進行多重同源性比較，構建分子系統(tǒng)樹（圖4）。在同源系數(shù)為92%的條件下，供試的26菌株被劃分為2個類群：第1類為尖孢鐮孢，共有14株，占54%，代表菌株F-H.6.5-030318-02；第2類為串珠鐮孢，共有12株，占46%，代表菌株Fm-H.6.5-030318-04。另外，第1類群中的尖孢鐮孢各菌株ITS區(qū)間的同源性達100%，而第2類群的串珠鐮孢，在同源系數(shù)為99%的條件下，又被細分為2個類群，菌株FmH.6.5-030318-04、Fm-H.6.5-030318-12、Fm-H.6.5-030318-13、Fm-X.1.7-030520-02和Fm-X.1.7-030527-31的同源性為100%聚為一類，菌株Fm-H.6.5-030318-11、Fm-T.1.7-030520、Fm-X.1.7-030520-11、Fm-X.1.7-030527-02、Fm-X.1.7-030527-08、Fm-T.1.7-040427-3和Fm-G.1.5-031017-05的同源性為100%聚為一類。2.6sahs2區(qū)的測序結果應用DNAMANversion5.2.2.0軟件對本研究中分離的兩種類型菌株（尖孢鐮孢和串珠鐮孢）的ITS1和ITS2分別進行比對分析，結果表明，兩種類型菌株的ITS區(qū)序列差異主要在于ITS2區(qū)間的差異，如圖5所示（圖中陰影部分表示兩類菌株在該位點的差異堿基），兩類型菌株在ITS2區(qū)的序列差異達20.4%，而它們的ITS1區(qū)間的序列完全相同或有1個堿基的差異（圖6）,ITS2區(qū)的序列差異類型為堿基的置換（其中轉(zhuǎn)換﹕顛換=9﹕25）和堿基的缺失。2.7his序列不同類型應用DNAMANversion5.2.2.0軟件對本研究中分離的14株尖孢鐮孢ITS區(qū)序列（包括ITS1、5.8S、ITS2）進行多重比較分析，結果顯示，14株尖孢鐮孢ITS區(qū)序列有3種不同的類型，類型I包括黃瓜上1個菌株F-H.6.5-030318-01(No.3），甜瓜上2個菌株F-T2.1.1-030616-01(No.11）和F-T2.1.1-030616-15(No12），瓠瓜上1個菌株F-G.1.5-031017-01(No.25），這4個菌株ITS序列完全相同；類型Ⅱ包括黃瓜上1個菌株F-H.6.5-030318-02(No.1），甜瓜上2個菌株F-T.1.7-030514-31(No.9）和F-T.1.7-040427-1(No.13），這3個菌株ITS序列完全相同；類型Ⅲ包括甜瓜上2個菌株F-T.1.7-030514-12(No.7）和F-T.1.7-030514-21(No.8），西瓜上5個菌株F-X.1.7-030520-03(No.16）、F-X.1.7-030520-12(No.18）、F-X.1.7-030520-13(No.19）、F-X.1.7-030527-11(No.21）和F-X.1.7-030527-12(No.22），這7個菌株的ITS序列完全相同。類型I菌株與類型Ⅱ菌株在376bp處有1個堿基（C/T）的差異，在103bp處，類型Ⅱ菌株比類型Ⅲ菌株少1個堿基（A）。2.8fm-x.5-33-菌株的his序列應用DNAMANversion5.2.2.0軟件對本研究中分離的12株串珠鐮孢ITS區(qū)序列（包括ITS1、5.8S、ITS2）進行多重比較分析，結果顯示，12株串珠鐮孢ITS區(qū)序列也有3種類型，類型Ⅰ菌株包括黃瓜上3個菌株Fm-H.6.5-030318-04(No.2）、Fm-H.6.5-030318-12(No.4）、Fm-H.6.5-030318-13(No.5）和西瓜上1個菌株Fm-X.1.7-030520-02(No.15），這4個菌株的ITS序列完全相同。類型Ⅱ只包括西瓜上1個菌株Fm-X.1.7-030527-31。類型Ⅲ包括黃瓜上1個菌株Fm-H.6.5-030318-11(No.6），甜瓜上2個菌株Fm-T.1.7-030520(No.10）和Fm-T.1.7-040427-3(No.14），西瓜上3個菌株Fm-X.1.7-030520-11(No.17）、Fm-X.1.7-030527-02(No.20）和Fm-X.1.7-030527-08(No.24），瓠瓜上1個菌株Fm-G.1.5-031017-05(No.26），這7個菌株的ITS序列相同。類型Ⅰ菌株與類型Ⅱ菌株在320bp處有1個堿基差異（T/C），類型Ⅰ菌株與類型Ⅲ菌株有3個堿基的差異，分別是在38bp處有1個堿基差異（A/C），在395bp處有1個堿基差異（T/C），在429bp處有1個堿基的差異（T/A）。3整體型分析結果鐮孢菌的分類鑒定是一項十分復雜的工作，傳統(tǒng)的鐮孢菌分類鑒定主要是以形態(tài)特征和生理生化指標作為該病原真菌分類鑒定的主要依據(jù)，但此方法受多種外界因素的影響，具有很大的不確定性，特別是有時培養(yǎng)物不典型或不產(chǎn)孢，使得鑒定工作更困難。因此，根據(jù)DNA水平的差異進行真菌的鑒定或系統(tǒng)發(fā)育的研究越來越得到重視。人們發(fā)現(xiàn)ITS區(qū)具有豐富變異特點，常常將這一可變區(qū)作為真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據(jù)之一，現(xiàn)已廣泛應用于Fusarium、Alternaria、Colletotrichum、Phytophthora、Rhizoctonia等病原真菌的分類鑒定上。本研究中分離自不同瓜類作物的枯萎病菌（Fusariumspp.），經(jīng)ITS區(qū)序列同源性搜索，發(fā)現(xiàn)它們屬于鐮孢菌的2個不同種：尖孢鐮孢（F.oxysporum）和串珠鐮孢（F.moniliforme）。由于尖孢鐮孢和串珠鐮孢的菌落及顯微形態(tài)特征相似，如它們的大型分生孢子都呈鐮刀狀，兩端漸尖，主要區(qū)別在于串珠鐮孢的大型分生孢子較直細，而它們的小型分生孢子都是呈長橢圓形或紡錘形。另外，尖孢鐮孢一般有厚垣孢子，而串珠鐮孢有時不出現(xiàn)厚垣孢子，但這些差異若不是經(jīng)驗性強的專家，很難將它們準確區(qū)分。而GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中有鐮孢菌屬許多種的ITS序列，所以可以通過測定鐮孢菌rDNA基因ITS序列，結合形態(tài)鑒定，這必將使得鐮孢菌的鑒定更為客觀、準確。本研究通過ITS區(qū)序列對瓜類作物枯萎病病原菌進行分類和比較分析，研究表明，供試的26株不同瓜類寄主作物的枯萎病病原菌被劃分為2大類群，第一類群為尖孢鐮孢，共有14株，占總菌株54%，說明尖孢鐮孢是瓜類作物枯萎病菌的優(yōu)勢病原菌，這一結果與劉志恒等認為尖孢鐮孢是引起瓜類作物枯萎病成災的主要病原菌的結論是一致的；第二類群為串珠鐮孢，共有12株，占總菌株46%。對尖孢鐮孢各菌株的ITS序列以及串珠鐮孢各菌株的ITS序列進行的多重