腐植酸吸附多環(huán)芳烴的降解菌的篩選與分離

腐植酸吸附多環(huán)芳烴的降解菌的篩選與分離

多環(huán)芳烴（pahs）污染土壤的恢復(fù)是當(dāng)前環(huán)境恢復(fù)研究的重點(diǎn)。生物降解是對PAHs污染土壤進(jìn)行修復(fù)的重要途徑之一。但是土壤中的PAHs的生物利用率一般較低,通常認(rèn)為,溶解于液相中的PAHs或其他的底物可被微生物利用,反之若被吸附于土壤上,則較難被微生物利用,如何將土壤中吸附的PAHs脫附出來,是提高PAHs的生物降解速率和降解效率的關(guān)鍵步驟。有研究表明,表面活性劑能促進(jìn)PAHs從土壤中釋放,使PAHs分配到表面活性劑膠束中或吸附到表面活性劑單體上,提高其生物有效性。腐植酸作為天然表面活性劑受到越來越多人的重視。腐植酸是高分子聚合物,具有親水性、吸附和絡(luò)合性能等,能有效提高多環(huán)芳烴的溶解性和遷移性。吸附于腐植酸(HA)上的多環(huán)芳烴解吸附對于其進(jìn)入微生物可利用相,以及進(jìn)一步的微生物降解過程非常必要。本實(shí)驗(yàn)選擇多環(huán)芳烴萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘污染土壤為污染物研究對象,用經(jīng)過HA吸附的多環(huán)芳烴富集培養(yǎng)出1株P(guān)AHs降解菌,分析其在污染物中的菌體形態(tài)、生理、生化性質(zhì)、對其進(jìn)行鑒定及進(jìn)化樹構(gòu)建,確認(rèn)其菌屬,研究HA吸附的PAHs其降解菌對PAHs的降解效率的影響,以期為多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和儀器土壤準(zhǔn)備:(1)菌源土壤:將0.5g腐植酸加入10.0g采集到的臺州市路橋固廢拆解場污染土壤(受多環(huán)芳烴污染),加入去離子水定容至50mL,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。(2)修復(fù)實(shí)驗(yàn)土壤:潔凈土壤在某高校0~20cm的深度表層土取樣,研磨后過2mm不銹鋼篩,經(jīng)測定土壤pH值為6.72,總有機(jī)碳為12.48g/kg,交換量(C.E.C)為45.04mg/kg。向土壤中投加萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘的丙酮溶液,待丙酮揮發(fā)后將處理土樣充分混勻滅菌,萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘的最終濃度各為200mg/kg土壤,分裝于土壤培養(yǎng)罐中,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),于培養(yǎng)后的第15天進(jìn)行土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)。腐植酸腐植酸(HA)由上海臣楓化學(xué)科技有限公司提供。其交換容量(C.E.C)為3.74mmol/g。菌種培養(yǎng)基(1)營養(yǎng)培養(yǎng)基:葡萄糖2.0%,酵母粉1.0%,胰蛋白胨2.0%,以蒸餾水定容,121℃滅菌25min。(2)無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基:K2HPO40.1%;MgSO4.7H2O0.05%;(NH4)2SO40.5%;pH6.0,以蒸餾水定容,121℃滅菌25min,加入10g/L的腐植酸溶液,加入100~200mg/L萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘的丙酮溶液作為碳源和能源,置于超凈工作臺紫外滅菌,待丙酮揮發(fā)后用于菌種的篩選富集。試劑:葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘、檸檬酸鈉、丙酮、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、KH2PO4等均為國產(chǎn)分析純。儀器:pHS-2C數(shù)顯酸度計(jì);JJ2000型精密電子天平;DSX-280B不銹鋼手提滅菌器;GRP-9050數(shù)顯隔水式培養(yǎng)箱;Micro22R型高速冷凍離心機(jī);XSP-5C生物顯微鏡;SW-CJ-1B標(biāo)準(zhǔn)型超凈工作臺;安捷倫1260型高效液相色譜儀等。1.2實(shí)驗(yàn)與研究方法1.2.1反映培養(yǎng)基上的個(gè)人信息富集篩選培養(yǎng)基以HA吸附的PAHs(萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘混合物)為主要碳源,采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、逐步提高碳源濃度的方法進(jìn)行篩選。(1)稱取適量菌源土壤,置于營養(yǎng)培養(yǎng)基中自然富集培養(yǎng)4d。(2)取上述富集培養(yǎng)液1mL接種于無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)(加入5g/L的腐植酸),此時(shí)萘、菲、熒蒽、芘、苯并蒽、苯并芘濃度初始各為100mg/L,于25℃,200r/min搖床富集培養(yǎng)4d。(3)再取前培養(yǎng)液1mL接種于無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基中(加入10g/L的腐植酸),此時(shí)萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘初始濃度增加至200mg/L,于25℃,200r/min搖床富集培養(yǎng)4d。(4)取(3)中所述選擇培養(yǎng)物稀釋涂布于固體無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)至有肉眼可見的明顯菌落長出,在固體無機(jī)鹽平板上連續(xù)劃線轉(zhuǎn)板3次。挑取菌落大,生長較快的單菌株接入噴涂有PAHs的營養(yǎng)培養(yǎng)基斜面,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pahs對16srrna的pcr檢測(1)菌體形態(tài)觀察和生理生化性質(zhì)平板菌落描述及革蘭氏染色光學(xué)顯微鏡觀察,透射電子顯微鏡觀察,對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。(2)PAHs降解菌株鑒定及進(jìn)化樹構(gòu)建菌種的16srDNA基因的PCR擴(kuò)增、測序由北京三博遠(yuǎn)志公司完成。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.3添加腐植酸和接種pahs降解菌株平均分為4個(gè)處理組:(1)對照污染土樣(CK):不加腐植酸、不接種;(2)接種PAHs降解菌株(Tzyx3);(3)添加腐植酸(HA);(4)添加腐植酸和接種PAHs降解菌株(HA+Tzyx3)。各處理均重復(fù)3次。選取修復(fù)實(shí)驗(yàn)土壤100g,PAHs降解菌株按2.0%用量與土壤混合均勻,腐植酸按5.0%用量與土壤混合均勻,加入去離子水定容500mL,放入恒溫振蕩器中,25℃下振蕩,在培養(yǎng)過程中的第1天、3天、5天、7天、9天、11天、13天、15天分別取樣測定土壤中殘留多環(huán)芳烴含量。1.2.4超聲波萃取土壤中PAHs含量采用超聲提取,HPLC法測定。提取方式為:用100mL的丙酮/正己烷(1∶2)混合液提取,然后用超聲器進(jìn)行超聲波萃取8h,重復(fù)提取一次,合并提取液。多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除有機(jī)溶劑,再溶于CH2Cl2溶液中,用含有正己烷的硅膠柱純化洗提。HPLC測定條件為:流動(dòng)相為甲醇/水=85/15(v/v);流速:1mL/min;柱溫為25℃;檢測波長為254nm;進(jìn)樣量為20μL;采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。2結(jié)果與分析2.1tyx3介紹通過HA吸附的PAHs作為碳源和能源而分離出的一高效PAHs降解菌,命名為Tzyx3。在降解菌的富集過程中,肉眼可見培養(yǎng)液中的懸浮的萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘逐漸減少,在無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基中菌體生長良好,表明HA吸附的PAHs可作為碳源和能源利于該菌生長。2.2抗帕斯分解菌的鑒定2.2.1菌株的培養(yǎng)特性Tzyx3可在10~35℃,pH值6.5~8.5培養(yǎng)條件下較好生長;菌株在營養(yǎng)培養(yǎng)基和無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)4d菌落特征為圓形,白色,表面光滑,邊緣齊整;細(xì)胞卵圓形,革蘭氏染色陽性,有芽孢,進(jìn)行出芽生殖,培養(yǎng)4d后出現(xiàn)不太發(fā)達(dá)的隔假菌絲。生理生化特征鑒定結(jié)果見表1。2.2.2tyx3與所需系統(tǒng)進(jìn)化性分析測序結(jié)果表明,Tzyx3的28SrDNA擴(kuò)增共得到575bp的核苷酸序列(圖1),將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中作BLAST分析,發(fā)現(xiàn)其與YarrowialipolyticaYF01h28SribosomalRNAgene序列相似度最高,為99%。利用ClustalX軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),由圖可知,Tzyx3與Yarrowialipolytica形成一個(gè)類群,序列同源性最高。結(jié)合菌株形態(tài)、菌落特征及生理生化特性鑒定結(jié)果,初步鑒定菌株屬于解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)。2.3土壤pahs的降解圖3(a),(b),(c),(d),(e),(f)分別表示了土壤經(jīng)過4種不同的方式處理后其中的PAHs萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽和苯并芘隨時(shí)間的動(dòng)力學(xué)降解曲線。由圖3可知,6種PAHs萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘在培養(yǎng)15d后都得到了不同程度的降解。未添加HA、未接種到土樣PAHs降解非常緩慢,因供試土壤經(jīng)過滅菌處理,土壤中不存在土著微生物,PAHs量的減少可能還要?dú)w因于PAHs的揮發(fā)。添加HA,接種Tzyx3后土壤PAHs含量在5d內(nèi)迅速降低,隨后降解速率變慢,在9d又加速降解,之后趨于平緩。腐植酸的加入極大地提高了PAHs的降解率,在腐植酸加入量為污染土壤的5.0%時(shí),即腐植酸在修復(fù)體系中的濃度為10.0g/L,此時(shí)腐植酸表面活性劑形成膠束,有機(jī)污染物能夠完全進(jìn)入膠束內(nèi)部,或吸附在膠束的疏水基上,使得萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘與表面活性劑分子一同進(jìn)入溶液中。降解15d后各實(shí)驗(yàn)土壤中PAHs含量順序?yàn)?CK>HA>Tzyx3>HA+Tzyx3。HA處理增強(qiáng)了多環(huán)芳烴降解菌對萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘的降解,HA+Tzyx3處理土壤PAHs萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘含量非常顯著低于CK、HA處理(P<0.01),Tzyx3處理土壤PAHs萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘含量顯著低于CK、HA處理(P<0.05),說明HA對PAHs的增溶性呈很好的相關(guān)關(guān)系,但對PAHs量的減少?zèng)]有多少貢獻(xiàn)。Tzyx3可以降解土壤中PAHs,但受土壤中的PAHs的生物利用率低的影響,降解率較低,而先用HA增溶洗提土壤中的PAHs,能降低油一水界面張力和減少PAHs在土壤上的吸附,可提高PAHs的生物可利用性,Tzyx3可以較好地降解土壤中PAHs。數(shù)據(jù)監(jiān)測顯示,15d后HA+Tzyx3處理土壤多環(huán)芳烴的去除率為:萘90.7%、菲91.0%、芘86.9%、熒蒽74.7%、苯并蒽84.7%、苯并芘74.7%。3降低pahs的最佳條件(1)用HA吸附的PAHs(萘、菲、芘、熒蒽、苯并蒽、苯并芘混合物)為培養(yǎng)基的碳源,對固廢拆解場受多環(huán)芳烴污染土壤進(jìn)行了篩選,經(jīng)過馴化培養(yǎng)、富集篩選,分離出的一高效PAHs降解菌,命名為Tzyx3。通過ITS基因序列分析結(jié)果表明,菌株與YarrowialipolyticaYF01h同源性最高,結(jié)合菌株形態(tài)、菌落特征及生理生化特性,鑒定Tzyx3菌為解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipol