實(shí)驗(yàn)講義-分光光度法測(cè)量溶液中色素含量

分光光度法測(cè)量溶液中色素含量引言（實(shí)驗(yàn)背景）在物質(zhì)檢測(cè)分析領(lǐng)域，對(duì)樣品測(cè)試時(shí)往往直接采用化學(xué)方法，或先采用化學(xué)方法預(yù)處理后再采用物理方法進(jìn)行測(cè)試分析，這樣都要采用化學(xué)試劑，對(duì)環(huán)境造成二次污染。而純物理方法在整個(gè)測(cè)量過(guò)程沒有化學(xué)反應(yīng)，更多依賴于物理手段和數(shù)學(xué)處理來(lái)解決問(wèn)題，符合環(huán)境友好型社會(huì)的發(fā)展需求，受到國(guó)家的重視和社會(huì)各界的歡迎。隨著測(cè)試方法的轉(zhuǎn)變，人才需求也隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變。以往利用化學(xué)分析方法進(jìn)行物質(zhì)檢測(cè)分析，需要大批量化學(xué)、生物相關(guān)專業(yè)人才。而隨著物理測(cè)試方法的廣泛采用，光學(xué)、光電專業(yè)人才需求越來(lái)越大。為了順應(yīng)社會(huì)需求，適應(yīng)形勢(shì)變化，光學(xué)、光電專業(yè)學(xué)生不僅要掌握制造分光光度計(jì)的技術(shù)，還要?jiǎng)?chuàng)新使用方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練積累知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，以便達(dá)到社會(huì)人才需求標(biāo)準(zhǔn)，為推動(dòng)社會(huì)的技術(shù)進(jìn)步和發(fā)展作貢獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c內(nèi)容食品中常添加色素使外觀好看而吸引消費(fèi)者，特別是食品飲料中常常使用人工色素配制成各種顏色。而毒理學(xué)證明化學(xué)合成色素有不同程度的毒性，有的甚至可致癌。各國(guó)相繼制訂了法規(guī)，對(duì)食品中合成色素的使用做了限量規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪且捎霉鈱W(xué)方法測(cè)出溶液中常用的色素含量。溶液中常使用三種色素顯示黃色、橙色或紅色：檸檬黃、日落黃和胭脂紅，本實(shí)驗(yàn)要求：實(shí)驗(yàn)前一周進(jìn)行預(yù)習(xí)查資料，設(shè)計(jì)出使用分光光度計(jì)同時(shí)測(cè)出溶液中檸檬黃、日落黃和胭脂紅的含量的實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)方案包括：1）實(shí)驗(yàn)所需條件，包括儀器設(shè)備、材料試劑、工具器材等；2）配制哪些溶液？測(cè)量哪些數(shù)據(jù)？并設(shè)計(jì)好記錄數(shù)據(jù)的表格以及主要實(shí)驗(yàn)步驟（注：分光光度計(jì)輸出的數(shù)據(jù)量較大，每個(gè)樣品的測(cè)量結(jié)果以文件形式保存，請(qǐng)先擬好文件名，填入表格，以免搞錯(cuò)）；3）由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算檸檬黃、日落黃和胭脂紅的含量的方法，并說(shuō)明所需使用的軟件或擬編寫的程序。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案至少提前一天（需要特殊材料的方案須提前一周）交給任課老師審閱，通過(guò)審閱后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按照所設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，配制所需溶液，并使用分光光度計(jì)測(cè)出相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)記錄單須交老師審查簽字。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按數(shù)據(jù)處理要求進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，一周內(nèi)上交實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)報(bào)告包括實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)處理結(jié)論及誤差分析、思考題。實(shí)驗(yàn)原理分光光度法是根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的單色光的吸收程度不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法，常采用吸收光譜曲線來(lái)進(jìn)行分析。所謂吸收光譜曲線，即將不同波長(zhǎng)的光依次通過(guò)某一固定濃度和厚度的有色溶液，分別測(cè)出它們對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度（用吸光度A表示），以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖所畫出曲線。由于溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收程度是不同，不同溶液的吸收曲線，其形狀和最大吸收波長(zhǎng)都各不相同，如圖1所示，可以作為定性分析的基礎(chǔ)。圖1不同溶液的光譜吸收曲線1760年，朗伯通過(guò)研究后指出：如果溶液的濃度一定，則光對(duì)物質(zhì)的吸收程度與它通過(guò)的溶液厚度成正比(1)A為吸光度；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；b為液層厚度；K0為比例常數(shù)。 1852年，比耳(Beer)提出光的吸收和光所遇到的吸收物質(zhì)數(shù)量有關(guān)；即當(dāng)單色光通過(guò)液層厚度一定的有色溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液濃度成正比。(2)A為吸光度；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；C為溶液的濃度；K1為比例常數(shù)。 將朗伯(Lambert)定律和比耳(Beer)定律合并，則為朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律(3)式中：A為吸光度；T為透射率；b為液層厚度(光程長(zhǎng)度)，通常以cm為單位；C為溶液的濃度，一般為物質(zhì)的摩爾濃度，單位為mol·L-1；ε為摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol-1·cm-1；（注意：吸光系數(shù)有三種表示方式：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol-1·cm-1，對(duì)應(yīng)濃度單位為mol/L；吸光系數(shù)，單位L·g–1·cm-1，對(duì)應(yīng)濃度單位為g/L；比吸光系數(shù)，單位100mL·g–1·cm-1，對(duì)應(yīng)濃度單位為g/100mL。）需要說(shuō)明的是，（3）式中的比例系數(shù)ε對(duì)不同波長(zhǎng)的光，其值是不同的，所以吸光度A隨波長(zhǎng)呈變化的曲線。同一溶液，不同濃度，其吸收曲線的形狀相似，最大吸收波長(zhǎng)也一樣，根據(jù)朗伯-比耳定律，其吸光度與溶液濃度成正比，如圖2所示，可利用吸收曲線結(jié)合吸光度對(duì)溶液物質(zhì)含量進(jìn)行定量分析。圖2同溶液不同濃度光譜吸收曲線 所以，對(duì)于單組分溶液，根據(jù)最大吸收峰處的吸光度，即可算出溶液中該物質(zhì)的濃度。具體方法是：先配制已知濃度的溶液，測(cè)出吸光度，根據(jù)（3）式計(jì)算出吸光系數(shù)；而后再測(cè)待測(cè)樣品的吸光度，由（3）式計(jì)算樣品的濃度。 對(duì)于多組分溶液，如果各組分之間無(wú)相互作用，其吸光度具有加和性，根據(jù)朗伯-比耳定律有：(4)如各組分光譜有疊加，則通過(guò)解聯(lián)立方程組可以確定各組分的濃度。以三組分混合液為例，先用混合液繪制出吸收光譜，再分別用其中的每單一組分繪制出各自的吸收光譜，而后根據(jù)所測(cè)三條吸收譜線選擇三個(gè)合適的波長(zhǎng)，在這三個(gè)波長(zhǎng)處對(duì)混合物樣品進(jìn)行測(cè)定，其方程式如下：(5)(6)(7)應(yīng)用行列式克萊姆法則，則可計(jì)算獲得C1、C2、C3。同一物質(zhì)，不同的測(cè)試波長(zhǎng)有不同的摩爾吸收系數(shù)，即有不同的靈敏度，由于實(shí)際實(shí)驗(yàn)有誤差，吸光度較小處相對(duì)誤差較大，而最大吸收波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)最大，分析測(cè)試的靈敏度最高，且最大吸收波長(zhǎng)處吸光度絕對(duì)誤差變化最小，所以三個(gè)波長(zhǎng)分別選在三種物質(zhì)的吸收峰處較合適。當(dāng)用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，一般會(huì)對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，即同時(shí)給出許多波長(zhǎng)下的測(cè)量值，這時(shí)為了充分利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)減小誤差，可采用最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理（參考附錄3）。一般情況下，采用分光光度法對(duì)某種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，物質(zhì)的吸光系數(shù)是未知的，為了獲取物質(zhì)的吸光系數(shù)，常用下列方法：絕對(duì)法：選擇待測(cè)物質(zhì)的吸收峰波長(zhǎng)，通過(guò)書刊、手冊(cè)查閱待測(cè)物質(zhì)在吸收峰波長(zhǎng)處吸光系數(shù)，利用實(shí)驗(yàn)所得的吸光度或透射率或反射率計(jì)算獲得待測(cè)物質(zhì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法：在同樣的條件下配制標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液，在所選波長(zhǎng)處分別測(cè)量吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液的A標(biāo)及A樣，通過(guò)獲得樣品濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列已知具有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在選定波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A，然后以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系方程。在相同條件下測(cè)量樣品溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系方程即可獲得樣品溶液濃度。標(biāo)準(zhǔn)加入法：在樣品溶液中加入已知具有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在選定波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度，根據(jù)吸光度變化量和所加已知具有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度變化量的關(guān)系，進(jìn)而獲得樣品待測(cè)物含量。分光光度計(jì)?是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，它主要由光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器、信息顯示系統(tǒng)組成。分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)組成框圖如圖3所示。光源光源單色器吸收池檢測(cè)器信號(hào)顯示及儀器控制圖3分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)框圖光源主要提供符合要求的入射光，較常用氘燈(165-375nm)和鎢燈(320-2500nm)。單色器是將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成連續(xù)光譜并可從中選出任一波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)，主要由狹縫、色散元件（棱鏡、光柵）和透鏡系統(tǒng)組成。吸收池又叫比色皿，是用于盛放待測(cè)溶液和決定透光液層厚度的器件，主要有石英吸收池和玻璃吸收池兩種。檢測(cè)器是利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)的器件，常用的有硒光電池、光電管、光電倍增管等。實(shí)驗(yàn)儀器和試劑儀器：UV-4501S紫外可見分光光度計(jì)，TU1901紫外可見分光光度計(jì)（帶兩個(gè)1cm石英比色皿）；基本操作步驟見附錄1。電子天平；容量瓶、移液管、燒杯等玻璃儀器。試劑：檸檬黃、日落黃、胭脂紅（試劑說(shuō)明見附錄2）；乙酸銨；光學(xué)純水；思考題分光光度計(jì)有哪些類型？分別有什么特點(diǎn)？測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生誤差的原因有哪些，并簡(jiǎn)要進(jìn)行分析？注意事項(xiàng)：在配制所需濃度溶液過(guò)程中，天平讀數(shù)要精確；玻璃儀器要輕拿輕放，配制完后，清洗干凈放回原處。所配制溶液濃度在最大吸收波長(zhǎng)處吸光度最佳范圍為0.2~0.8，相當(dāng)于本實(shí)驗(yàn)所用溶液濃度范圍為20~200μg/mL。濃度高低也可以用一定體積（與使用的容量瓶有關(guān)，如100mL）中含儲(chǔ)備液多少來(lái)表示（如1mL，3mL等），可稱“體積濃度”。等數(shù)據(jù)處理完成后，再將它轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)濃度單位。在一次測(cè)量完成后，比色皿須經(jīng)光學(xué)純水清洗，待測(cè)濃度溶液清洗后，再加入待測(cè)溶液進(jìn)行測(cè)試。分光光度計(jì)測(cè)量常常涉及數(shù)十個(gè)甚至上千個(gè)波長(zhǎng)數(shù)據(jù)，要想利用好這些數(shù)據(jù)，就可能要解數(shù)目巨大的方程組，所以僅靠手工計(jì)算是不可能的，需要編程計(jì)算或利用軟件計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)提供VB編寫的計(jì)算軟件程序或自行采用MATLAB軟件或其他軟件進(jìn)行計(jì)算。附錄1：光譜儀基本操作步驟(1)開機(jī)，儀器參數(shù)設(shè)置：打開分光光度計(jì)電源開關(guān)，預(yù)熱約20min；在Windows操作系統(tǒng)下啟動(dòng)光譜儀程序，待計(jì)算機(jī)與光譜儀通訊成功，可進(jìn)入主工作程序；選擇附屬功能-狹縫設(shè)置設(shè)定狹縫寬度。狹縫寬度過(guò)大時(shí)，入射光的單色光降低，校準(zhǔn)曲線偏離比耳定律，靈敏度降低；狹縫寬度過(guò)窄時(shí)，光強(qiáng)變?nèi)?，儀器的增益提高，儀器噪聲增大，于測(cè)量不利。選擇附屬功能-波長(zhǎng)設(shè)置設(shè)定波長(zhǎng)范圍，波長(zhǎng)范圍太大，測(cè)試時(shí)間太長(zhǎng)，并增加數(shù)據(jù)處理量，增加誤差；波長(zhǎng)范圍太小，不能完全覆蓋物質(zhì)的吸收光譜寬度，測(cè)試數(shù)據(jù)不全，增加測(cè)量誤差；因而選擇合適的波長(zhǎng)范圍，可以有效減少誤差。選擇測(cè)試-波長(zhǎng)掃描進(jìn)入波長(zhǎng)掃描界面-模式選擇吸光度或透射率；選擇測(cè)試-波長(zhǎng)掃描進(jìn)入波長(zhǎng)掃描界面-參數(shù)設(shè)置對(duì)掃描次數(shù)、掃描速度、起止波長(zhǎng)、坐標(biāo)上下限進(jìn)行設(shè)定；在參考通道與物光通道分別插入裝有蒸餾水的石英比色皿，蓋好防塵蓋，選擇附屬功能-建立基線進(jìn)行基線掃描。(2)關(guān)機(jī)測(cè)量工作結(jié)束后，退出系統(tǒng)。先關(guān)閉系統(tǒng)軟件，再關(guān)閉分光光度計(jì)。取出分光光度計(jì)內(nèi)參考通道和物光通道比色皿分別清洗干凈后交老師收存?？截惡脤?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，退出Windows操作系統(tǒng)，關(guān)閉電源。附錄2試劑說(shuō)明(1)檸檬黃(酒石黃，Tartrazine)檸檬黃是3-羧基-5-羧基-1-(對(duì)磺苯基)-4-(對(duì)磺苯基偶氮)鄰氮茂的三鈉鹽，屬單偶氮類色素，結(jié)構(gòu)式如下：檸檬黃外觀為橙黃色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇、微溶于乙醇，不溶于油脂，對(duì)熱、酸、光及鹽均穩(wěn)定，耐氧性差，遇堿變紅色，還原時(shí)褪色。最大使用量0.1g/kg，最大吸收波長(zhǎng)426nm(2)日落黃(SunsetYellow)日落黃是1-(對(duì)磺酸苯基偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二鈉鹽，屬單偶氮類色素，結(jié)構(gòu)式如下：其外觀為橙紅色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。最大使用量0.1g/kg，最大吸收波長(zhǎng)482nm(3)胭脂紅(麗春紅4R，Ponceau4R)胭脂紅是1-(4’-磺基-1’-萘偶氮)-2-萘酚-6,8-其外觀為紅色粉末，易溶于水、甘油，微溶于乙醇和乙二醇一乙醚混合溶液。最大使用量0.05g/kg檸檬黃、日落黃和胭脂紅的光譜吸收曲線如圖4所示圖4檸檬黃、日落黃和胭脂紅的光譜吸收曲線附錄3最小二乘法當(dāng)在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得自變量x與因變量y的n個(gè)對(duì)應(yīng)，，…,時(shí)，要找出已知類型的函數(shù)關(guān)系，使（稱為殘差）的平方和最小，即：，這種求的方法，稱為最小二乘法。 設(shè)函數(shù)殘差為S，則所得的殘差線性方程組如（1）式所示：(1)根據(jù)數(shù)學(xué)分析知，欲使殘差的平方和S取值最小，要滿足的條件是，，…，且其二階導(dǎo)數(shù)大于0。經(jīng)整理得：(2)對(duì)(1)式中各方程求二階偏導(dǎo)數(shù)恒為正，因而(1)式中各方程求得的極值為最小值，滿足最小二乘條件，則有：(3)式稱為最小二乘法估計(jì)的正規(guī)方程。將正規(guī)方程寫成矩陣形式，可表示為：(4)整理(4)式有(5)對(duì)(5)式兩邊分別左乘，