基于rd1區(qū)抗原的全血干擾素釋放實(shí)驗(yàn)對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值

基于rd1區(qū)抗原的全血干擾素釋放實(shí)驗(yàn)對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值

由于缺乏詳細(xì)的細(xì)菌診斷依據(jù)，臨床表現(xiàn)往往不典型或無(wú)異常。細(xì)菌陰道的診斷一直是臨床醫(yī)生面臨的難題，往往導(dǎo)致診斷和漏診。皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)是近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)一直被用于結(jié)核感染和活動(dòng)性結(jié)核診斷的細(xì)胞免疫功能的體內(nèi)試驗(yàn)。由于所使用的抗原結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)與卡介苗(BCG)及部分環(huán)境分枝桿菌(NTM)之間存在交叉反應(yīng),使得TST試驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果而導(dǎo)致特異性下降,是TST試驗(yàn)的主要缺陷。此外,TST試驗(yàn)在機(jī)體免疫功能受損時(shí),常常呈現(xiàn)假陰性或無(wú)反應(yīng)的結(jié)果,使得其盡管價(jià)廉,但臨床診斷意義一直備受質(zhì)疑。1996年,通過(guò)比較基因組學(xué)的研究確定了BCG在體外傳代過(guò)程中丟失的區(qū)域,定義為缺失區(qū)(RD),ES-AT-6與CFP-10即是RD1區(qū)編碼的兩種早期分泌蛋白,是重要的T細(xì)胞抗原,能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IFN-γ和強(qiáng)烈的遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)(DTH),利用結(jié)核菌RD1區(qū)抗原誘發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答并使用ELISA的方法檢測(cè)所產(chǎn)生高水平的IFN-γ的方法是全血γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)的基本原理。本研究采用全血γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)的方法,探討該方法在菌陰肺結(jié)核中的診斷價(jià)值并探討其潛在的臨床應(yīng)用潛能,現(xiàn)報(bào)告如下。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例對(duì)照的年齡分布選取2010年6月至2012年6月北京胸科醫(yī)院住院患者、新入職職工、健康體檢的學(xué)生共計(jì)182例,男98例,女84例,所有患者要求HIV(-),無(wú)妊娠,無(wú)應(yīng)用免疫抑制劑和免疫增強(qiáng)劑史,抗結(jié)核治療少于1周,分為菌陽(yáng)肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組、肺部其他疾病對(duì)照組、健康對(duì)照組。菌陽(yáng)肺結(jié)核組44例,年齡17~90歲,平均(46.6±18.4)歲;菌陰肺結(jié)核組47例,年齡16~76歲,平均(38.3±16.8)歲;肺部其他疾病對(duì)照組56例,年齡36~82歲,平均(55.8±11)歲;健康對(duì)照組35例,年齡18~27歲,平均(21.8±2.11)歲。1.2病例對(duì)照結(jié)果菌陽(yáng)肺結(jié)核組:痰集菌連續(xù)至少兩次(+)或痰結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性至少1次;菌陰肺結(jié)核組:至少3次痰集菌及1次培養(yǎng)陰性,具有典型活動(dòng)性肺結(jié)核臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn),排除其他非結(jié)核肺部疾病,進(jìn)一步監(jiān)測(cè)經(jīng)抗結(jié)核治療病變吸收良好病情好轉(zhuǎn)的病例;疾病對(duì)照組:包括肺癌(43例)、肺部其他疾病(13例),所有肺癌患者均經(jīng)活檢病理證實(shí),肺部其他疾病主要包括臨床或病理診斷的肺炎、肺間質(zhì)病變、肺部良性腫瘤病例,所有患者無(wú)合并活動(dòng)性肺結(jié)核或影像學(xué)無(wú)陳舊結(jié)核病變的病例;健康對(duì)照組:為新入職職工和健康體檢的學(xué)生,要求無(wú)結(jié)核接觸史、無(wú)臨床癥狀、胸片檢查無(wú)異常表現(xiàn)、卡痕陰性、ELISPOT陰性的無(wú)其他疾病的健康人群。1.3方法1.3.1血漿樣品的收集結(jié)核組患者和疾病對(duì)照組患者于入院次日清晨抽取空腹靜脈血5ml,置于真空肝素抗凝管中;健康組統(tǒng)一采血,清晨抽取空腹靜脈學(xué)10ml,置于真空肝素抗凝管中。采血后6小時(shí)內(nèi)將靜脈血1ml加入24孔培養(yǎng)板內(nèi),共5孔,每孔依次加入PHA(陽(yáng)性對(duì)照)、PPD、ESAT-6、ESAT-6/CFP-10和生理鹽水(陰性對(duì)照),并于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜約16~22小時(shí),次日收集血漿至少300μl,于-20℃保存,收集的血漿采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的IFN-γ檢測(cè)試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作。其中PPD、ESAT-6、ESAT-6/CFP-10由中國(guó)生物制品檢定所王國(guó)治主任惠贈(zèng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,為達(dá)到最大刺激濃度,各抗原的終濃度分別為PHA(20μg/ml)、PPD(20μg/ml)、ESAT-6(40μg/ml)、ESAT-6/CFP-10(20μg/ml),最后1孔加入等體積生理鹽水。1.3.2roc曲線(xiàn)的構(gòu)建根據(jù)菌陽(yáng)肺結(jié)核組和健康對(duì)照組中ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD3種抗原刺激的IFN-γ分泌量,構(gòu)建ROC曲線(xiàn),根據(jù)曲線(xiàn)下面積確立各抗原cut-off值:ESAT-6的cut-off值為31pg/ml時(shí),敏感性為81.8%,特異性為80%;ESAT-6/CFP-10融合抗原的cut-off值為1458pg/ml時(shí),敏感性為81.8%,特異性為88.6%;PPD的cut-off值為2068pg/ml時(shí),敏感性為86.4%,特異性為60%。1.4評(píng)估結(jié)果的基準(zhǔn)1.4.1esat-6孔PPD孔陽(yáng)性定義為≥2068pg/ml且3倍于陰性對(duì)照孔,陰性對(duì)照孔<100pg/ml;ESAT-6孔陽(yáng)性定義為≥31pg/ml且3倍于陰性對(duì)照孔,陰性對(duì)照孔<100pg/ml;ESAT-6/CFP-10孔陽(yáng)性定義為≥1458pg/ml且3倍于陰性對(duì)照孔,陰性對(duì)照孔<100pg/ml。1.4.2esat-6孔PPD孔陰性定義為<2068pg/ml且陽(yáng)性對(duì)照孔>150pg/ml,陰性對(duì)照孔<100pg/ml;ESAT-6孔陰性定義為<31pg/ml且陽(yáng)性對(duì)照孔>150pg/ml,陰性對(duì)照孔<100pg/ml;ESAT-6/CFP-10孔陰性定義為<1458pg/ml且陽(yáng)性對(duì)照孔>150pg/ml,陰性對(duì)照孔<100pg/ml。1.4.3陰性對(duì)照孔陽(yáng)性對(duì)照孔<150pg/ml且抗原孔為陰性時(shí),或陰性對(duì)照孔>100pg/ml。由于機(jī)體對(duì)陽(yáng)性刺激不反應(yīng),或由于污染使得陰性對(duì)照孔出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),使得無(wú)法判定結(jié)果為陽(yáng)性還是陰性,需要重新檢測(cè)。1.5樣本率和相關(guān)率實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)值型數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布的采用中位數(shù)(M)和極差表示。各組樣本率的比較和相關(guān)性應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P<0.05差異有顯著性。2結(jié)果2.1干擾釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1比較了ESAT-6、ES-AT-6/CFP-10融合抗原、PPD3種抗原刺激的γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)在健康組和肺結(jié)核組之間陽(yáng)性率的差異,結(jié)果顯示健康組和結(jié)核組之間存在顯著差異,結(jié)核組3種抗原刺激的γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性率顯著高于健康組的陽(yáng)性率。在去除了無(wú)法確定的結(jié)果后,這種差異更加顯著(P<0.05)。2.2干法釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2比較了ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD3種抗原刺激的γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)在菌陽(yáng)肺結(jié)核組和菌陰肺結(jié)核組之間陽(yáng)性率的差異,結(jié)果顯示兩組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。2.3菌株間的融合表3比較了ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD3種抗原刺激的γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)在菌陰肺結(jié)核組和疾病對(duì)照組之間陽(yáng)性率的差異,結(jié)果顯示菌陰肺結(jié)核組和疾病對(duì)照組之間各抗原存在顯著差異,菌陰肺結(jié)核組3種抗原刺激的γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性率顯著高于疾病對(duì)照組。ESAT-6/CFP-10融合抗原和PPD的敏感性最好(83.0%),而ESAT-6/CFP-10融合抗原的特異性最好(85.7%),PPD的特異性最差(51.2%),聯(lián)合ESAT-6或ESAT-6/CFP-10融合抗原任一陽(yáng)性的敏感性可達(dá)83.0%,特異性可達(dá)76.8%。在去除了無(wú)法確定的結(jié)果后,這種差異更加顯著(P<0.05)。3全血干擾釋放實(shí)驗(yàn)的臨床應(yīng)用價(jià)值γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)最早用于結(jié)核潛伏感染的研究,近年逐漸用于臨床活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷和鑒別診斷,實(shí)驗(yàn)所使用的設(shè)備簡(jiǎn)單便宜,操作易于掌握,更利于普及。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)全血γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)的臨床研究還少,需要更加廣泛的應(yīng)用和評(píng)價(jià)。我國(guó)屬于結(jié)核病高負(fù)荷國(guó)家,結(jié)核菌潛伏感染率較高,為除外結(jié)核菌潛伏感染對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,本研究選擇了ELISPOT(-)的35例健康人作為對(duì)照組。在疾病對(duì)照組的選擇上,由于TST實(shí)驗(yàn)受BCG接種狀態(tài)的影響而導(dǎo)致假陽(yáng)性率很高,使得疾病對(duì)照組的選擇出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性。本研究?jī)H從流行病學(xué)和臨床特征選擇對(duì)照組,即無(wú)結(jié)核接觸史、結(jié)核病臨床表現(xiàn),影像學(xué)無(wú)活動(dòng)結(jié)核和陳舊結(jié)核病變的肺癌組和肺部其他疾病組,進(jìn)一步考察全血γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)在臨床菌陰肺結(jié)核的診斷與鑒別診斷價(jià)值。在對(duì)91例肺結(jié)核組(包括菌陽(yáng)肺結(jié)核組和菌陰肺結(jié)核組)和35例健康對(duì)照組IFN-γ分泌量增高的陽(yáng)性率比較顯示:PPD的敏感性最好(84.6%),其敏感性高的原因主要是PPD為多種抗原的復(fù)合物,但是相應(yīng)的其特異性也最差(60%),主要原因是受BCG接種的影響。ESAT-6與ESAT-6/CFP-10融合抗原的敏感性和特異性接近并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;聯(lián)合ESAT-6或ES-AT-6/CFP-10融合抗原任一陽(yáng)性可以將敏感性提高至85.7%,而特異性?xún)H輕度下降78.1%,在去除了無(wú)法確定結(jié)果后聯(lián)合ESAT-6或ESAT-6/CFP-10融合抗原任一陽(yáng)性的敏感性可達(dá)88.6%,特異性可達(dá)79.4%,顯示了較好的敏感性和特異性,可用于臨床結(jié)核病的診斷。3種抗原在菌陽(yáng)肺結(jié)核組和菌陰組中的陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于菌陽(yáng)肺結(jié)核可以通過(guò)痰菌得以確診,而菌陰肺結(jié)核在臨床中診斷常常較為困難,因此,全血γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究中,共有7例無(wú)法確定結(jié)果產(chǎn)生,均是由于PHA陽(yáng)性刺激孔無(wú)反應(yīng)產(chǎn)生的,其中,健康對(duì)照組僅1例,結(jié)核組3例(菌陰肺結(jié)核組2例、菌陽(yáng)肺結(jié)核組1例),肺癌組3例,無(wú)法確定結(jié)果產(chǎn)生可能與機(jī)體的免疫功能降低有關(guān)。研究表明,無(wú)論使用ELISA的方法還是使用ELISPOT的方法,在HIV-TB感染的患者中都出現(xiàn)了一定比例無(wú)法確定的結(jié)果,并且無(wú)法確定的結(jié)果更易出現(xiàn)于CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低的患者。結(jié)核組另外3例無(wú)法確定結(jié)果,分別產(chǎn)生于菌陰肺結(jié)核