第四章-病毒的遺傳分析

第四章

病毒的遺傳分析病毒（virus）既不屬于原核生物，也不屬于真核生物，屬非細胞型生命形態(tài)，又稱為分子生物。其一般特點是：1.個體極小介于10～300nm之間，能夠通過細菌濾器；基本形態(tài)有：■桿狀，如煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）■球形，如腺病毒（adenovirus）■蝌

蚪狀，是大部分噬菌體的典型形態(tài)，如λ噬菌體和T偶數(shù)噬菌體均為蝌蚪形。2.無細胞結(jié)構(gòu)核心

+衣殼（核衣殼）核心:DNA或RNA衣殼由許多蛋白質(zhì)亞單位衣殼體以對稱的形式，規(guī)則排列而成。有的病毒在核衣殼外還有囊膜、包膜、被膜、外膜等結(jié)構(gòu)，膜的表面還有突起：刺突、囊膜粒等。3.沒有完整的酶系和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。離體條件下，以無生命的化學大分子狀態(tài)存在，可形成結(jié)晶，不能進行獨立的代謝活動。4.嚴格的活細胞內(nèi)寄生，以復制的方式增殖。5.對抗生素不敏感，但對干擾素敏感。通常按宿主類型病毒分為：1.噬菌體細菌病毒、真菌病毒及藻類病毒2.植物病毒感染高等植物、藻類等真核生物的病毒3.動物病毒昆蟲病毒和脊椎動物病毒遺傳學研究中應用最廣泛的是噬菌體，這是因為：1.繁殖快2.基因組小3.突變體多第一節(jié)噬菌體的繁殖和突變型第二節(jié)噬菌體突變型的重組實驗第三節(jié)噬菌體突變型的互補測驗第四節(jié)缺失作圖第一節(jié)

噬菌體的繁殖和突變型

一、噬菌體的繁殖根據(jù)噬菌體和宿主的關(guān)系可分為：烈性噬菌體（virulentphage）溫和噬菌體（temperatephage）1.烈性噬菌體（virulentphage）的增殖這種噬菌體感染宿主細胞后就進入裂解反應，使宿主細胞裂解。如：大腸桿菌T系噬菌體2.溫和噬菌體的增殖這種噬菌體感染宿主細胞后具有裂解和溶源兩種發(fā)育途徑。如：λ噬菌體整合到宿主染色體中的噬菌體基因組稱為原噬菌體（prophage）或原病毒（provirus）。帶有原噬菌體的細菌稱為溶源性細菌（lysogenicbacterium），以上過程稱為溶源周期。溶源性細菌有兩個重要特性：①免疫性②可誘導性失去原噬菌體的細菌稱為非溶源性細菌（non-lysogenicbacterium）。二、噬菌體的突變型1.條件致死突變型(1)溫度敏感突變（temperaturesensitivemutation，ts）■熱敏感突變型：通常在30℃感染宿主進行繁殖，但在40～42℃就是致死的?！?/p>

冷敏感突變型：在較低溫度下就致死。(2)抑制因子敏感突變（suppressorsensitivemutation，sus）■

sus突變的實質(zhì)：是原來正常的密碼子變成了終止密碼子，因而翻譯提前終止，不能形成完整肽鏈而產(chǎn)生有活性的蛋白質(zhì)?！?/p>

sus突變分為3類：琥珀突變（amber，amb），相應的密碼子為UAG赭石突變（ochre，och），相應的密碼子為UAA乳白突變（opal，op），相應的密碼子為UGA■

帶有sus突變的噬菌體在感染一種帶有抑制基因（suppressor，su＋）的宿主菌時能產(chǎn)生子代?！鲈诟腥玖硪环N沒有抑制基因（su-）的宿主菌時，不能產(chǎn)生子代。2.噬菌斑形態(tài)突變型■大、小噬菌斑由于侵染宿主細胞后溶菌速度的快慢而形成?！銮逦?、混濁噬菌斑由于被感染細菌全部或是部分被殺死而形成。■

噬菌體感染細菌時，首先吸附于細胞表面的專一受體上，這是由受體的基因控制的，如果受體發(fā)生改變，有可能使噬菌體不能附著，從而該噬菌體的宿主范圍就縮小?！隽硗?噬菌體突變也可以擴大寄生范圍。3.宿主范圍突變型大腸桿菌BK（λ）S野生型小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑rⅠ大噬菌斑大噬菌斑小噬菌斑rⅡ大噬菌斑無噬菌斑（致死）小噬菌斑rⅢ大噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑第二節(jié)

噬菌體突變型的重組實驗■1955年■

T4的兩個rⅡ不同突變型r47＋和＋r104■

用兩種突變型噬菌體感染同一宿主細菌，叫雙重感染（doubleinfection）→進入裂解周期→兩個噬菌體偶然地發(fā)生交換→它們的后裔可以出現(xiàn)重組子。因此可以進行染色體作圖分析。一、Benzer的重組測驗r47＋＋r104大腸桿菌BK（λ）野生型小噬菌斑小噬菌斑rⅡ大噬菌斑無噬菌斑（致死）1.r47+2.+r1043.r47r1044.++親本型重組型由于rⅡ雙重突變的交互重組子r47r104在大腸桿菌K（λ）菌株上不能生長，所以無法檢出，但是它的頻率和＋＋相等，因此重組子數(shù)=大腸桿菌K（λ）菌株上＋＋的噬菌斑數(shù)乘以2，代入公式：這一測定方法稱為重組測驗（recombinationtest），它是以遺傳圖的方式確定突變子之間的空間關(guān)系的。例：噬菌體T4＝1500mapunits(1.8×105bp)如果兩個rⅡ突變子產(chǎn)生0.01%突變子，則意味突變是由0.02圖單位所分開。占整個T4Genome:0.02/1500=1.3×10-5T4phage有：1.8×105bp所觀察到的最小重組距離：（1.3×10-5）×（1.8×105）＝2.4bp這意味Benzer’s結(jié)果已顯示遺傳重組可能出現(xiàn)在2個堿基對順序的距離內(nèi)，后來由其他人的實驗已做出結(jié)論性的說明，重組可出現(xiàn)在影響DNA中鄰近堿基對的突變之間。也就是說：遺傳實驗已經(jīng)說明堿基對既是突變單位（unitofmutation）也是重組單位（uniteofrecombination）以前用來計算重組的方法是計算基因與基因之間的距離，而Benzer的方法可以用來測算一個基因內(nèi)部不同位點的距離，它的精確度可達到十萬分之一，也就是0.001個圖距單位，故稱作基因的精細作圖。二、T2突變型的兩點測交與作圖1940年AlfredHershey&R.RotmanT2噬菌體突變型：r－：噬菌斑形態(tài)突變型，快速溶菌，產(chǎn)生大噬菌斑r+：野生型，緩慢溶解，產(chǎn)生小噬菌斑h－：宿主范圍突變型，既能溶裂E.coliB品系1也能溶裂品系2

h+：能夠溶裂E.coliB品系1，不能溶解品系2把T2噬菌體接種到大腸桿菌品系1和2的混合培養(yǎng)物上時，噬菌斑是半透明的。

類型大腸桿菌B品系1品系2r+小噬菌斑小噬菌斑r-大噬菌斑大噬菌斑h+裂解不裂解h-裂解裂解類型大腸桿菌B品系1和品系2的混合h+r-半透明大噬菌斑h-r+透明小噬菌斑h+r+半透明小噬菌斑h-r-透明大噬菌斑h+r-h-r+h+r+h-r-大腸桿菌Bh+r-h-r+h+r-h-r+大腸桿菌B品系1和品系2的混合半透明大噬菌斑透明小噬菌斑半透明小噬菌斑透明大噬菌斑h+r-h-r+h+r+h-r-半大透小透大半小分別統(tǒng)計各種噬菌斑的數(shù)目，由此計算出重組值，去掉%，作為圖距進行作圖。不同速溶性噬菌體的突變在表型上不同，可分別寫成ra-、rb-、rc-等，用h＋rx-×h-rx＋獲得的試驗結(jié)果如下：每一雜交得一連鎖圖:三種不同的重組值，表示三個r基因的座位是不同的，所以有4種可能的連鎖圖：三、T4突變型的三點測交與作圖用T4噬菌體的兩個品系感染E.coli?！鲆粋€品系:mrtu（小噬菌斑、快速溶菌、渾濁溶菌斑）突變型?！隽硪粋€品系對這3個性狀都是野生型（＋＋＋）的。根據(jù)上述結(jié)果，可繪出這3個基因的染色體圖：符合系數(shù)C=實際雙交換值/理論雙交換值

=（1.6+1.7）/（12.9×20.8）

=1.23干涉值=1-C=1-1.23=-0.23負干涉四、λ噬菌體的基因重組與作圖（自學）1955年，Kaiser進行了λ噬菌體的重組作圖試驗用紫外線照射處理得到5個λ噬菌體的突變系：■

s系產(chǎn)生小噬菌斑■mi系產(chǎn)生微小噬菌斑■c系產(chǎn)生完全清亮的噬菌斑■

co1系產(chǎn)生除中央一個環(huán)之外其余部分都清亮的噬菌斑■

co2系產(chǎn)生比co1更濃密的中央環(huán)噬菌斑。8個類型中數(shù)目最少的兩種類型就是雙交換的結(jié)果，頻率最高的兩種是親本類型，其余的為單交換類型。用sco1mi×＋＋＋雜交，所得后代有8種類型從雙交換的類型可知，這3個基因的次序就是s－co1－mis與co1的圖距應為3.83cM；co1與mi之間則為6.21cM；因為有雙交換的存在，s與mi之間的圖距則為8.32＋2×0.86＝10.043個基因的遺傳圖:第三節(jié)

噬菌體突變型的互補測驗一、互補測驗原理和方法重組測驗是以遺傳圖距的方式確定基因的空間關(guān)系?；パa測驗則是確定突變基因的功能關(guān)系?！?957年，Benzer■大腸桿菌T4噬菌體■通過互補實驗，在DNA分子水平上，研究快速溶菌突變型rⅡ的基因精細結(jié)構(gòu)。Benzer的互補試驗：①用兩個不同的rⅡ突變型rⅡA和rⅡB同時感染（共感染）E.coliK12(λ)，結(jié)果可以互相彌補對方的缺陷，共同在菌體內(nèi)增殖，引起溶菌，釋放原來的兩個突變型。②用rⅡA中的兩個突變型，共感染或用rⅡB中的兩個突變型共感染E.coliK12（λ）菌株，都不能互補，不產(chǎn)生溶菌現(xiàn)象互補作用是指二個突變型染色體同處在一個細胞中，由于相對的野生型基因的互相補償而使表型正?；淖饔谩；パa測驗方法：斑點測試法（spottest）A用一種rⅡ突變型以0.1的感染比（噬菌體1／細菌10）去感染大腸桿菌K（λ）菌株。B噬菌體和細菌在溫熱的瓊脂中混合，涂布在營養(yǎng)平板上。C瓊脂凝固后，在平板上所劃出的一定位置上再加一滴含有另一種rⅡ突變型的培養(yǎng)基，在這一滴培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，一些細菌就會被兩種噬菌體所感染。D如在這范圍內(nèi)形成噬菌斑，就證明這兩種突變型互補，相反就不能互補。在一個培養(yǎng)皿平板上可做6～8個斑點試驗。二、順反子兩個突變?nèi)绻謩e位于兩條染色體上，這種組合方式稱為反式排列。兩個突變同時位于一條染色體上，則稱為順式排列。當兩個突變型的順式排列互補表現(xiàn)為野生型，反式排列不互補表型為突變型，這兩個突變位點應屬于同一基因。當兩個突變型順式、反式排列都表現(xiàn)為野生型，它們應屬于不同的功能基因，位于不同的座位上。Benzer

將這樣一個不同突變之間沒有互補的功能區(qū)稱為順反子，即遺傳的功能單位就是一個順反子。第四節(jié)

缺失作圖Benzer在研究rⅡ突變型時發(fā)現(xiàn)其中一些突變是由于缺失了單個或相鄰的許多堿基對，因此稱為缺失突變（deletionmutation）。缺失作圖原理：利用一系列缺失突變型，把所要測定的突變型和這一系列缺失突變型分別進行重組測定，凡是能和某一缺失突變型進行重組的，它的位置一定不在缺失范圍內(nèi)，凡是不能重組的，它的位置一定在缺失范圍內(nèi)。通過與一系列的缺失突變型進行重組的結(jié)果，可以精確確定某待測突變型（點突變）的位置。不能產(chǎn)生野生型能產(chǎn)生野生型突變位點在缺失范圍內(nèi)突變位點不在缺失范圍內(nèi)第一步：將待測的突變型與最上方的7個“大缺失”突變型分別進行雜交，以確定這一突變位點所屬的大范圍。例如：將待測突變型rⅡ548分別與已知的7個“大缺失”突變型雜交，結(jié)果是它和缺失突變型A105和638能發(fā)生重組，而與其他5個都不發(fā)生重組，就可確定這一突變位點在區(qū)域A5中。

12721241J3PT1PB242A105638rⅡ548第二步：將待測突變型進一步與有關(guān)的“小缺失”突變型分別進行雜交，以縮小這一突變所屬的范圍。例如：將待測突變型與