基于sybrgren線性pcr方法檢測(cè)羊傳染性膿皰病

基于sybrgren線性pcr方法檢測(cè)羊傳染性膿皰病

綿羊感染病毒（orf.v）是天花感染科的一種代表性藥物。它是山羊、綿羊和其他反芻動(dòng)物感染的重要病原體，對(duì)山羊的影響最大。以唇部、鼻孔周?chē)⒖谇火つず腿榉康炔课黄つw形成丘疹、水皰、膿皰和痂皮為特征,主要引起皮膚和黏膜的增生性病變。據(jù)報(bào)道,該病毒可在與病羊的接觸過(guò)程中直接傳染給人。所以,該病為人獸共患傳染病,傳染性強(qiáng),發(fā)病率高,呈世界性流行,最早于1920年發(fā)現(xiàn)于歐洲,現(xiàn)已廣泛分布于全世界。在我國(guó)青海、甘肅、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古以及東北三省等地均有該病發(fā)生和流行的報(bào)道,給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,并已對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了威脅。目前對(duì)該病的診斷方法主要有反向間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)和ELISA等,但這些方法存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、靈敏度或特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。常規(guī)PCR雖在這些方面有很大提高,但易出現(xiàn)假陽(yáng)性,且核酸染色劑(溴化乙錠,EB)是高致癌物質(zhì),對(duì)人體健康有很大危害。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是目前檢測(cè)基因表達(dá)的最準(zhǔn)確、靈敏的方法之一,已被廣泛應(yīng)用。其中SYBRGreenⅠ熒光染料法,以使用方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。本試驗(yàn)利用SYBRGreenⅠ熒光定量PCR技術(shù)建立了一種實(shí)時(shí)定量檢測(cè)ORFV的方法,旨在為羊傳染性膿皰病的早期快速診斷提供技術(shù)儲(chǔ)備。1材料和方法1.1小量抽提劑盒、dna凝膠回收試劑盒ORFV為吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存;UNIQ-10柱式病毒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;質(zhì)粒DNA小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;rTaqDNA聚合酶、pMD18-T載體、SYBRPremixExTaq購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。1.2病毒dna提取用DNA小量提取試劑盒提取病毒DNA,具體步驟參考試劑盒使用說(shuō)明。1.3ier5.0引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中的ORFVB2L基因序列,用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,P1:5′-GGGGCGGCGTATTCTTCT-3′,P2:5′-GCTGTTCTTGGCGTTCTCG-3′,目的片段大小為104bp。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.4rp-pcr擴(kuò)增dh5菌劑以提取的病毒基因組DNA為模板,采用25μL的PCR反應(yīng)體系,其中滅菌水16.5μL,ExTaq緩沖液2.5μL,2mmol/LdNTPs1.5μL,25pmol/LP1、P2各1μL,模板3μL,ExTaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)條件為:96℃2min30s;95℃30s,60℃30s,72℃30s,共40個(gè)循環(huán);72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后,于20g/L瓊脂糖凝膠中電泳。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,按pMD18-T載體說(shuō)明書(shū)將目的片段與載體連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。涂板后,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白色菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng),用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定、測(cè)序鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。1.5pcr檢測(cè)采用SYBRGreenⅠ染料法,在ABI-7000熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。采用三步法進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)體系為25μL,以出現(xiàn)最小Ct值和最高熒光值以及不出現(xiàn)非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn),分別對(duì)模板濃度、退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。1.6實(shí)時(shí)熒光定量pcr分別以羊痘病毒(SPV)、ORFV的DNA和PBS為模板,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(水),按照優(yōu)化的條件進(jìn)行SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR,進(jìn)行特異性比較;使用同一陽(yáng)性樣品DNA為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),每次試驗(yàn)每個(gè)樣品做3個(gè)平行的反應(yīng)管,重復(fù)4次;將1.4中制備的標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),比較它們的敏感性。1.7臨床樣品的檢測(cè)用本試驗(yàn)建立的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR法同時(shí)對(duì)送檢的20份羊傳染性膿胞病疑似病料進(jìn)行檢測(cè)。2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒pmd18-t-s1l的構(gòu)建提取病毒DNA后,用PCR方法擴(kuò)增ORFVB2L基因,得到一約104bp的目的片段。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-B2L,將其轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定,證實(shí)成功構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)序結(jié)果顯示,與各毒株間核苷酸和氨基酸的同源性分別為97.8%～99.5%和97.6%～99.5%。2.2pcr擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)體系為25μL:SYBRPremixExTaq12.5μL,10μmol/LP1、P2各1.0μL,ROXRefe-renceDye(50×)0.5μL,DNA模板2μL,用滅菌蒸餾水補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃30s,95℃5s,60℃20s,72℃31s,40個(gè)循環(huán)。在60℃退火溫度下擴(kuò)增曲線起跳早,熔解曲線峰值單一,熒光數(shù)值高,而陰性對(duì)照不能被擴(kuò)增。2.3實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)重組病毒模板將9.4×1010copies的ORFV做10倍遞增稀釋,以這些DNA為模板,按2.2的反應(yīng)條件同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線(見(jiàn)圖1)。由圖1可知,本試驗(yàn)建立的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以檢測(cè)到9.4×104copies的病毒模板,并在9.4×104～9.4×108copies/反應(yīng)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.999。對(duì)熔解曲線(見(jiàn)圖2)的分析表明,產(chǎn)物特異性很強(qiáng),熔解溫度均一,熔解曲線為單一峰值,說(shuō)明建立的方法靈敏度高,條帶單一,沒(méi)有雜帶,擴(kuò)增效果良好。2.4重復(fù)性試驗(yàn)cv使用同一模板重復(fù)3次進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,所得3條S型曲線相似,實(shí)際所得Ct值相同(見(jiàn)圖3);組間變異系數(shù)(CV)分別為1.89%、1.18%、0.9%和1.9%,均小于2%,表明該方法具有良好的重復(fù)性。分別將SPV和ORFV陽(yáng)性樣品的DNA及PBS作為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,除ORFV能夠擴(kuò)增出S型曲線,其他均不能檢測(cè)出S型曲線,與陰性對(duì)照(水)的擴(kuò)增結(jié)果相似(見(jiàn)圖4),表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。2.5sybr式回復(fù)突變檢測(cè)分別提取20份疑似ORFV感染病羊唇部痂皮基因組,并對(duì)其進(jìn)行SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果17份為ORFV陽(yáng)性;同時(shí)應(yīng)用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果僅有10份為陽(yáng)性。2.6實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法與臨床樣品的比較將常規(guī)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的臨床樣品、SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的臨床樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果表明,二者所擴(kuò)增的目的條帶均在同一位置,說(shuō)明本試驗(yàn)建立的方法與普通PCR一致(見(jiàn)圖5)。3pcr檢測(cè)結(jié)果SYBRGreenⅠ與所有的雙鏈DNA均能結(jié)合,所以由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。根據(jù)熔解曲線分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenⅠ得到的定量結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)對(duì)熔解曲線分析可見(jiàn)在反應(yīng)過(guò)程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體,特異性產(chǎn)物的Tm值在理論值±1℃左右均屬于正常范圍。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出,本試驗(yàn)建立的PCR方法線性關(guān)系良好,直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)r2可達(dá)0.999;靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示,ORFVSYBRGreenⅠPCR最低可以檢測(cè)到9.4×104copies的病毒模板;熔解曲線分析結(jié)果顯示,產(chǎn)物的Tm值相同,未出現(xiàn)非特異性波峰;在特異性試驗(yàn)中,只出現(xiàn)一特異性條帶,且與SPV無(wú)交叉反應(yīng);用該方法檢測(cè)不同濃度的質(zhì)粒模板,結(jié)果Ct值相對(duì)固定,組內(nèi)Ct值相同,組間變異系數(shù)小于2%,表明重復(fù)性良好。經(jīng)對(duì)20份臨床疑似病料進(jìn)行檢測(cè),本試驗(yàn)建立的方法檢出17份陽(yáng)性,而常規(guī)PCR僅檢出10份陽(yáng)性,此結(jié)果與病毒分離鑒定的結(jié)果一致,證實(shí)了該方法的可靠性。該方法可用于ORFV臨床病料的快速診斷。本試驗(yàn)建立的方法與TaqMan探針?lè)ㄏ啾雀?jiǎn)便,只需在SYBRGreenⅠ反應(yīng)混合液中加入引物和待測(cè)樣品的DNA即可,成本相對(duì)低廉,可用于