光學(xué)成像技術(shù)的空間探測(cè)和生物應(yīng)用

光學(xué)成像技術(shù)的空間探測(cè)和生物應(yīng)用

0阿貝-瑞利衍射積分公式自意大利科學(xué)家卡洛伊洛（galileo1564-1642）在17世紀(jì)發(fā)明了天文光學(xué)望遠(yuǎn)鏡（1562-1723）以來，光學(xué)成像技術(shù)在很大程度上促進(jìn)了人類文明的進(jìn)程，并將人類的觀察視野擴(kuò)展到了兩個(gè)極端世界。自19世紀(jì)末以來，德國(guó)科學(xué)家阿比（abe，1840-1905年）和英國(guó)科學(xué)家雷利（railigh，1842-1919年）根據(jù)光的變化理論，成像光學(xué)系統(tǒng)中的理想物體的圖像不是理想的幾何點(diǎn)的圖像，而是具有一定大小的光點(diǎn)（即艾里斑）。如果這兩個(gè)點(diǎn)非常接近，且這些圖像的重疊在一起，就無法區(qū)分兩個(gè)點(diǎn)的圖像。換句話說，光學(xué)系統(tǒng)的分辨率極限通?；谌鹄呐袛啵寒?dāng)一個(gè)點(diǎn)的中心與另一個(gè)點(diǎn)的第一個(gè)黑暗環(huán)重疊時(shí)，只能區(qū)分兩個(gè)點(diǎn)，即著名的瑞利判斷（railighcritenov），如下所示。δ=1.22(λ/D)f(1)式中λ表示在像方介質(zhì)中光的波長(zhǎng),f表示系統(tǒng)焦距,D表示孔徑,D/f為相對(duì)孔徑.在顯微光學(xué)系統(tǒng)中通常使用數(shù)值孔徑(NA=nsinα)表征,式(1)可以改寫為δ=0.61(λ0/NA)(2)式中λ0表示光的真空波長(zhǎng).由式(1)、(2)可知,要達(dá)到高分辨本領(lǐng),可以縮短波長(zhǎng)或提高相對(duì)(數(shù)值)孔徑,在可見光范圍內(nèi)其分辨率極限約為200nm.阿貝-瑞利衍射極限是在光的標(biāo)量衍射理論框架下得到的,實(shí)際上光是一種矢量波,描述它不僅有頻率、振幅和相位參量,還具有偏振特征.因此,完整描述光波應(yīng)該用矢量方程.20世紀(jì)中,美國(guó)科學(xué)家理查德(Richards)和沃爾夫(Wolf)給出了精確計(jì)算焦場(chǎng)分布的Richards-Wolf衍射積分公式E(r)=-ikf2πθmax∫02π∫0√cos(θ)l0(θ,φ)u(θ,φ)?exp(ik?r)sinθdφdθ(3)E(r)=?ikf2π∫0θmax∫02πcos(θ)?????√l0(θ,φ)u(θ,φ)?exp(ik?r)sinθdφdθ(3)式中l(wèi)0(θ,φ)表示物鏡入瞳面內(nèi)場(chǎng)的復(fù)振幅分布,u(θ,φ)表示入瞳面內(nèi)各個(gè)光線的偏振矢量經(jīng)過轉(zhuǎn)跡后在像空間內(nèi)的偏振矢量.可以證明,當(dāng)入射光為線偏振均勻照射時(shí),即l0(θ,φ)u(θ,φ)=1,由式(3)可以得到式(1)和(2).因此,Richards-Wolf積分公式是更一般的計(jì)算公式,它同時(shí)考慮了入射場(chǎng)的振幅、相位和偏振分布.那么在特定的偏振、相位和振幅分布情況下,所得到的光斑尺寸有可能小于阿貝-瑞利衍射極限決定的值.例如,在徑向偏振光照明的情況下,光斑的面積約為線偏振光照明下光斑面積的61.5%,可顯著縮小光斑尺寸.通過設(shè)計(jì)特殊的波前振幅或相位“濾波器”,也可以達(dá)到縮小光斑尺寸的目的,例如:用一個(gè)不透明的圓形物體來阻擋入瞳處入射場(chǎng)的中心區(qū)域,即采用環(huán)形光入射,當(dāng)被阻擋的中心區(qū)域增大時(shí),聚焦亮斑逐漸縮小.由上述分析可見,對(duì)于聚焦掃描成像光學(xué)系統(tǒng),采用特殊調(diào)制的入射光束可以獲得更小的聚焦光斑尺寸,突破常規(guī)的阿貝-瑞利衍射極限,但是其改善程度并不是很大.而對(duì)凝視或?qū)拡?chǎng)成像光學(xué)系統(tǒng),則不能使用這種照明方式,需要其它特殊的結(jié)構(gòu)光照明方式來提高分辨率.以上是從純光學(xué)方法的角度考慮來提高成像的分辨率,如果利用光與物質(zhì)相互作用的一些非線性光學(xué)效應(yīng),則可以獲得更加豐富多彩的超分辨光學(xué)成像方法.另外,光學(xué)系統(tǒng)的成像分辨率除了與光學(xué)鏡頭有關(guān)外,還與探測(cè)器的分辨率、信噪比、靈敏度,以及圖像處理技術(shù)等因素有關(guān),需要綜合考慮.本文將從應(yīng)用的角度出發(fā),分別討論高分辨光學(xué)成像技術(shù)在空間探測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用,以及超分辨光學(xué)成像技術(shù)在生物領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用.1空間分辨率的提高空間高分辨率光學(xué)成像技術(shù)在光學(xué)遙感、軍事偵查、天文觀測(cè)以及深空探測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛而迫切的需求.目標(biāo)圖像的高分辨一直是人們所追求的重要指標(biāo)之一,它是軍事目標(biāo)發(fā)現(xiàn)與識(shí)別,以及人類認(rèn)識(shí)太空、研究宇宙的最主要手段.空間成像技術(shù)主要包括凝視成像技術(shù)和推掃成像技術(shù).空間分辨率通常以像元分辨率(又稱為地元分辨率)表示,在理想光學(xué)系統(tǒng)及噪聲忽略的情況下,與空間物體到光學(xué)鏡頭的距離H和CCD像元尺寸d的乘積成正比,與光學(xué)系統(tǒng)焦距f成反比,表示為Ds=d·H/f(4)然而由于經(jīng)典光學(xué)系統(tǒng)都是一個(gè)衍射受限系統(tǒng),意味著并不能單純依靠減小CCD像元尺寸或增大光學(xué)系統(tǒng)的焦距來無限制提高空間分辨率,最多可以達(dá)到的理論極限為式(1)表示的衍射極限分辨率.另外,對(duì)于圖像而言,信噪比是一個(gè)重要的性能指標(biāo),成像系統(tǒng)的信號(hào)收集能力也是一個(gè)重要設(shè)計(jì)約束,它正比于系統(tǒng)的相對(duì)孔徑的平方.因此,要獲得更高分辨率的圖像,需要增大光學(xué)系統(tǒng)的口徑,但口徑的增大必然導(dǎo)致儀器體積和重量非常大,使得研制、發(fā)射和運(yùn)行等費(fèi)用也相應(yīng)變得非常昂貴.因此,提高空間分辨率必須在考慮系統(tǒng)重量和體積的基礎(chǔ)上,考慮相應(yīng)的手段措施,主要包括以下幾個(gè)方面:1.1我國(guó)探月與探月成像技術(shù)及系統(tǒng)簡(jiǎn)介足夠的信號(hào)強(qiáng)度是保證圖像質(zhì)量的前提,由于信號(hào)強(qiáng)度正比于光學(xué)系統(tǒng)相對(duì)孔徑的平方,要在較小的相對(duì)孔徑下實(shí)現(xiàn)高分辨率,必須提高探測(cè)器的靈敏度.時(shí)間延遲積分CCD(TDI-CCD)是在CCD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的探測(cè)器件,它基于對(duì)同一目標(biāo)多次曝光,通過延遲積分的方法大大增加了光能的收集,與一般線陣CCD相比,它大大提高了靈敏度,并拓寬了動(dòng)態(tài)范圍.在米級(jí)及亞米級(jí)高分辨率衛(wèi)星相機(jī)上(如QuickBird、OrbView-3、嫦娥二號(hào)和火星快車等)得到了很大的發(fā)展和應(yīng)用.圖1是由中國(guó)科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所研制的我國(guó)探月工程嫦娥二號(hào)CCD立體相機(jī)拍攝的月球虹灣區(qū)形貌照片,圖像清晰層次豐富,其1m分辨率的局域立體影像使我國(guó)成為繼美國(guó)(2009年)之后第二個(gè)在對(duì)月探測(cè)中具備1m量級(jí)分辨率成像能力的國(guó)家,為嫦娥三號(hào)“落”提供了高分辨的著落點(diǎn)及周邊地區(qū)的地形地貌數(shù)據(jù).該相機(jī)既能在100km圓軌上獲取地元分辨率為7m的全月面立體圖像,又能在100km×15km橢圓軌道的近月弧段上獲取地元分辨率為1m的虹灣區(qū)局域立體圖像,這一方面要求相機(jī)具有超高的探測(cè)靈敏度,同時(shí)又要求具有大的動(dòng)態(tài)范圍.這是國(guó)際上首次使用雙線陣TDI-CCD自推掃成像技術(shù)拍攝的高分辨月球照片,還拍攝到了月球兩極永久陰影區(qū)的立體圖像.但由于TDI-CCD工作原理的限制,其要求行掃速率與目標(biāo)運(yùn)動(dòng)速率嚴(yán)格同步,否則會(huì)造成圖像信息的混疊,所以該技術(shù)對(duì)平臺(tái)姿態(tài)以及速高比匹配提出了較高的需求.在嫦娥二號(hào)CCD立體相機(jī)中,采用了速高比精密補(bǔ)償技術(shù),成功地解決了該問題,獲得國(guó)際領(lǐng)先的研究成果.此外,為了進(jìn)一步提高探測(cè)靈敏度,通過角補(bǔ)償鏡增加凝視時(shí)間也是一種途徑,如EROS-A和印度的TES以及部分星載高光譜成像儀中有所應(yīng)用.不過,由于其對(duì)補(bǔ)償鏡的穩(wěn)定度要求較高,同時(shí)不能連續(xù)場(chǎng)景工作,使其受到限制.1.2波前編碼成像技術(shù)在系統(tǒng)空間分辨率未受到衍射極限限制的情況下,應(yīng)盡量提高CCD傳感器的空間采樣頻率.減小傳感器像素,可以更加細(xì)致地描述理想像面處離散化的光學(xué)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù).離散化的光學(xué)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)與理想的連續(xù)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)越接近,成像系統(tǒng)的空間分辨率就越高.但由于CCD像元尺寸不可能太小,亞像元成像技術(shù)成為解決空間采樣問題的重要技術(shù)手段之一,它是一種非常經(jīng)濟(jì)有效的實(shí)現(xiàn)遙感衛(wèi)星高分辨率和小型化的技術(shù)途徑.早在1984年,Tsni和Huang首次提出用多幅欠采樣圖像來提高圖像空間分辨率的設(shè)想;隨后,國(guó)外許多研究所、大學(xué)和公司相繼開展了這方面的研究.Kodak公司利用增頻采樣獲取的多幅圖像進(jìn)行超分辨率融合得到更高分辨率的圖像.美國(guó)Dayton大學(xué)和Wright實(shí)驗(yàn)室在美國(guó)空軍的支持下,對(duì)紅外CCD相機(jī)進(jìn)行了機(jī)載試驗(yàn),利用重復(fù)拍照的20幅低分辨率的紅外圖像,取得了分辨率提高近5倍的結(jié)果.中國(guó)科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所也曾對(duì)兩幅相同空間分辨率的圖像進(jìn)行圖像重建后,獲得空間分辨率提高1.6倍左右的結(jié)果.在空間對(duì)地觀測(cè)中,法國(guó)SPOT、美國(guó)EarthSat、德國(guó)BIRD衛(wèi)星都嘗試采用該項(xiàng)技術(shù),利用增頻采樣、衛(wèi)星重訪和多個(gè)衛(wèi)星獲取圖像,從而獲得重構(gòu)高分辨率圖像.其中SPOT-5衛(wèi)星更是在其超級(jí)模式下,利用兩幅同時(shí)獲取的5m分辨率的全色圖像重采樣得到2.5m分辨率的全色圖像.另一種技術(shù)方案是采用波前編碼成像技術(shù).該技術(shù)首先由美國(guó)科羅拉多大學(xué)的Cathey和Dowski于1995年提出.通過在系統(tǒng)的孔徑平面、入瞳或者出瞳面上添加一塊特殊設(shè)計(jì)的三次方型相位掩模板,系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)就能夠?qū)﹄x焦不敏感.但是,相位板會(huì)引起調(diào)制傳遞函數(shù)的下降,因此波前編碼系統(tǒng)所獲得的圖像將呈現(xiàn)出一種均勻一致的模糊,必須依靠圖像復(fù)原算法去除模糊之后,才能獲得大景深清晰圖像.波前編碼成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于,它能夠使成像系統(tǒng)對(duì)離焦參量本身及引起離焦的因素(如振動(dòng)、溫度變化等導(dǎo)致的光機(jī)結(jié)構(gòu)的改變)不敏感.利用此原理,韓國(guó)Lee等人提出了一種將圖像放大技術(shù)、升采樣技術(shù)和復(fù)原技術(shù)相結(jié)合的成像及處理模式,可以在CCD像元尺寸不變的情況下實(shí)現(xiàn)更高分辨率的成像.他們首先使用波前編碼技術(shù)將系統(tǒng)所對(duì)應(yīng)的光學(xué)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)有意地?cái)U(kuò)展;其次,通過數(shù)字的方式構(gòu)建更小像素所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù);再次,將原始大像素所對(duì)應(yīng)的圖像通過插值放大到與小像素所匹配的像素分辨率水平,而此時(shí)經(jīng)過放大的圖像將出現(xiàn)模糊現(xiàn)象;最后,把構(gòu)建好的小像素所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)作為卷積核,采用經(jīng)典復(fù)原算法,如維納濾波等作用于經(jīng)過數(shù)字放大的圖像,實(shí)現(xiàn)像素?cái)?shù)目與分辨率的同步提升.他們將1.4μm的500萬像素圖像提升放大到了0.7μm的2000萬像素圖像,效果很明顯.不過需要注意的是,這種分辨率的提升是因?yàn)椴ㄇ熬幋a技術(shù)的特殊性.傳統(tǒng)成像系統(tǒng)在設(shè)計(jì)階段就要求系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)盡可能地尖銳,以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像.在這種情況下,采用韓國(guó)研究人員的方案就很難實(shí)現(xiàn)像元物理尺寸時(shí)分辨率的提升.因此,必須采用特殊設(shè)計(jì)的波前編碼系統(tǒng)才能提升系統(tǒng)的分辨率.1.3多產(chǎn)生鏡系統(tǒng)傳統(tǒng)光學(xué)成像系統(tǒng)角分辨率受波長(zhǎng)和系統(tǒng)孔徑的限制,對(duì)特定的工作波段提高系統(tǒng)的角分辨率,只能增大系統(tǒng)孔徑,而在實(shí)際應(yīng)用中系統(tǒng)加工成本和飛行器有效載荷體積等很多因素限制了系統(tǒng)孔徑的增大.20世紀(jì)70年代提出的合成孔徑干涉成像技術(shù)為提高成像系統(tǒng)分辨率提供了新的方法,它利用幾個(gè)分離的小孔徑光學(xué)系統(tǒng)組合來實(shí)現(xiàn)大孔徑的分辨極限.光學(xué)合成孔徑技術(shù)從結(jié)構(gòu)形式上可分兩類:共用子鏡形式和多望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)形式.前者取整塊主鏡上的若干部位組成子鏡,以主鏡排列方式組成主鏡;后者將多個(gè)孔徑壓縮在一個(gè)小孔徑成像系統(tǒng)中成像來獲得接近大孔徑成像的分辨率效果,該結(jié)構(gòu)形式獲得的離散孔徑多為非連續(xù),又稱為稀疏孔徑技術(shù).NASA準(zhǔn)備接替Hubble的下一代天文望遠(yuǎn)鏡(NGST)的方案之一——JamesWebb空間望遠(yuǎn)鏡是共用次鏡形式的典型代表,其主鏡是一個(gè)分塊可展開鏡,它由36個(gè)對(duì)邊距離為1m的六邊形分塊子鏡分3圈組成,外接圓的直徑大于8m.1978年美國(guó)亞里桑那建造的MMT(MultipleMirrorTelescope)是多望遠(yuǎn)鏡形式的典型代表,它由六塊1.8m的子望遠(yuǎn)鏡組成等效孔徑相當(dāng)于直徑4.45m的望遠(yuǎn)鏡.另外一個(gè)用于天文觀測(cè)的地基稀疏孔徑成像系統(tǒng)是LBT(LargeBinocularTelescope),它由兩個(gè)8.4m的主鏡組成,在一個(gè)方向上具有相當(dāng)于口徑22.8m的口徑所限制的光學(xué)分辨率.法國(guó)AlcatelSpace公司在高軌高分辨率光學(xué)相機(jī)的概念設(shè)計(jì)中提出九孔徑干涉光學(xué)相機(jī)方案,它利用空間編隊(duì)飛行的多個(gè)望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)組成大口徑系統(tǒng),是多望遠(yuǎn)鏡結(jié)構(gòu)光學(xué)合成孔徑技術(shù)的一種變形形式,從原理上這種結(jié)構(gòu)系統(tǒng)可以做到非常大,直徑可達(dá)100m.1.4傅里葉望遠(yuǎn)鏡成像技術(shù)上面討論的成像技術(shù)都是利用目標(biāo)自身發(fā)光或反射光進(jìn)行成像,稱為被動(dòng)成像技術(shù).主動(dòng)成像技術(shù)是由儀器自身發(fā)出光照明目標(biāo),然后接收目標(biāo)反射回來的信號(hào)進(jìn)行成像的技術(shù),如激光雷達(dá)是一種典型的主動(dòng)成像技術(shù).傅里葉望遠(yuǎn)鏡技術(shù)是一種借助于激光主動(dòng)照明,對(duì)暗弱目標(biāo)成像的方法,角分辨率能夠達(dá)到幾納弧度.它通過幾束激光照射目標(biāo),在目標(biāo)表面形成干涉條紋,在幾個(gè)激光束之間引入相移,使干涉條紋在目標(biāo)表面移動(dòng).產(chǎn)生的時(shí)間調(diào)制激光回波包含目標(biāo)反射的傅里葉分量信息(該傅里葉分量由光束發(fā)射器的間距和方向確定),再用大型太陽(yáng)能匯聚鏡陣列收集回波信號(hào),通過逆傅里葉變換給出目標(biāo)圖像.基于該技術(shù)美國(guó)空軍實(shí)驗(yàn)室建立了地球同步軌道衛(wèi)星激光成像國(guó)家實(shí)驗(yàn)基地(GLINT),用于實(shí)施和驗(yàn)證傅里葉望遠(yuǎn)鏡技術(shù),GLINT的等效口徑約100m,系統(tǒng)角分辨率可達(dá)到0.002″.2超分辨熒光顯微成像技術(shù)現(xiàn)代生物學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展對(duì)微觀結(jié)構(gòu)的研究提出了越來越高的分辨率需求,希望從分子水平揭示生命過程和材料性能的物理本質(zhì).受光學(xué)衍射極限的限制,普通光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率一般只能達(dá)到200nm,縱向分辨率約500nm,這對(duì)于研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)已無能為力.雖然電子顯微鏡和原子力顯微鏡可以達(dá)到亞納米的分辨率,但是其只能對(duì)非活性離體細(xì)胞樣品進(jìn)行觀測(cè)的缺點(diǎn)限制了其在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用.因此,如何利用光學(xué)方法突破傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限進(jìn)入納米觀測(cè)領(lǐng)域成為光學(xué)顯微成像技術(shù)的一個(gè)重要挑戰(zhàn)和機(jī)遇.光學(xué)顯微成像技術(shù)在生物學(xué)中的普遍應(yīng)用很大程度得益于各種熒光探針分子的出現(xiàn),使用不同的熒光分子可以標(biāo)記樣品的不同部位和細(xì)胞器,通過探測(cè)特定波長(zhǎng)激發(fā)熒光分子發(fā)出的熒光(主動(dòng)成像技術(shù)),可以對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的單分子進(jìn)行實(shí)時(shí)成像.借助熒光探針分子,利用激發(fā)光與熒光分子相互作用產(chǎn)生的非線性光學(xué)效應(yīng),發(fā)展了各種各樣的超分辨光學(xué)成像方法.光學(xué)顯微成像技術(shù)根據(jù)探測(cè)模式可以分為兩大類:即點(diǎn)掃描成像技術(shù)和寬場(chǎng)成像技術(shù).以激光共聚焦熒光顯微(ConfocalMicroscopy)為代表的點(diǎn)掃描成像技術(shù),用高度聚焦的激光束對(duì)樣品逐點(diǎn)掃描成像,熒光信號(hào)經(jīng)過探測(cè)針孔濾波后被光電倍增管探測(cè)收集,由于只有激光焦點(diǎn)處激發(fā)的熒光可以通過探測(cè)針孔,所以激光共聚焦顯微具有極低的背景噪聲,而且通過逐層掃描樣品,可以實(shí)現(xiàn)三維成像,但是激光共聚焦熒光顯微的橫向分辨率并沒有超過衍射極限.多光子熒光顯微與共聚焦顯微很類似,不同的是它使用超短脈沖激光作為激發(fā)光源.由于多光子吸收是非線性效應(yīng),只發(fā)生在焦點(diǎn)處,所以探測(cè)器前不需要針孔濾光,并且由于激發(fā)光使用長(zhǎng)波段的近紅外光,故具有探測(cè)樣品更深層結(jié)構(gòu)的能力.寬場(chǎng)成像技術(shù)采用面陣圖像傳感器(如CCD),可以在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得一幅完整的二維圖像,具有速度快、圖像灰度級(jí)高等優(yōu)點(diǎn).但是由于受樣品離焦部分的干擾,普通的寬場(chǎng)成像技術(shù)不具有三維層析成像能力.全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TotalInternalReflectionFluorescentMicroscope,TIRFM)是一種寬場(chǎng)成像技術(shù),它利用光線全反射后在界面產(chǎn)生衰逝波激發(fā)樣品,因?yàn)樗ナ挪◤?qiáng)度垂直于界面呈指數(shù)衰減,使激發(fā)區(qū)域僅限定在樣品表面的一薄層范圍內(nèi)(小于200nm),從而大大降低了背景光噪聲,近年來已被廣泛應(yīng)用于單分子熒光成像中,但其分辨率也受到衍射極限的制約.近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡(ScanningNear-FieldOpticalMicroscope,SNOM)不受衍射極限的制約.1928年,Synge提出用亞波長(zhǎng)的小孔在樣品表面掃描獲取樣品衰逝場(chǎng)信息,從而可以獲得亞波長(zhǎng)的分辨率.但是受制于工作距離以及樣品,SNOM基本屬于接觸測(cè)量,不適用于活體生物樣品的觀察.另外,近場(chǎng)圖像是樣品與探測(cè)針尖信息的混合物,如果針尖大于被分析物體的細(xì)微結(jié)構(gòu),所得到的像則更多地與針尖特性有關(guān),而不是與樣品的結(jié)構(gòu)相關(guān).近年來,隨著各種新型熒光探針分子的出現(xiàn)和成像方法的改進(jìn),遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)成像的分辨率已經(jīng)突破了衍射極限的限制.遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)超分辨熒光顯微成像技術(shù)主要分為兩大類:一類是基于單分子定位技術(shù)的超分辨顯微成像方法,包括光激活定位顯微技術(shù)(PhotoactivatedLocalizationMicroscopy,PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(StochasticOpticalReconstructionMicroscopy,STORM);另一類是基于特殊強(qiáng)度分布照明光場(chǎng)的超分辨顯微成像方法,包括受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(StimulatedEmissionDepletion,STED)和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(StructuredIlluminationMicroscopy,SIM).除此之外,對(duì)于非熒光顯微成像方法,本文將介紹具有三維成像能力的數(shù)字全息顯微成像技術(shù).2.1熒光分子的檢測(cè)使用高靈敏度的探測(cè)器和高信噪比的顯微成像技術(shù)可以得到單個(gè)熒光分子的光學(xué)圖像,但是這個(gè)單個(gè)熒光分子的顯微圖像是一個(gè)接近衍射極限的艾里斑,其強(qiáng)度半高寬取決于光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PointSpreadFunction,PSF).單分子熒光成像本身不能突破衍射極限,但是當(dāng)顯微鏡視場(chǎng)中只有一個(gè)或幾個(gè)熒光分子的時(shí)候,該熒光分子的位置通過特定的算法擬合,可以達(dá)到亞納米級(jí)的精確測(cè)量.單分子的二維定位精度a可近似地表示為a=Δx/√Νa=Δx/N??√,其中Δx為光學(xué)系統(tǒng)PSF的半高寬,N為單個(gè)熒光分子發(fā)出的光子數(shù),對(duì)于量子效率較高的熒光染料,單個(gè)熒光分子圖像可以貢獻(xiàn)一百萬個(gè)光子,因此單分子定位精度可以達(dá)到1nm以下.2006年,Betzig等人首次提出了基于單分子定位技術(shù)的PALM技術(shù).PALM的基本原理是用PA-GFP綠熒光蛋白來標(biāo)記蛋白質(zhì),通過調(diào)節(jié)405nm激光器的能量,低能量照射細(xì)胞表面,一次僅激活視野下稀疏分布的幾個(gè)熒光分子,然后再用488nm激光照射激發(fā)熒光,通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子的位置.隨后再使用488nm激光照射來漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子,使它們不被下一輪的激光再激活出來.之后,再分別用405nm和488nm激光來激活和漂白其它的熒光分子,進(jìn)入下一次循環(huán).經(jīng)過持續(xù)多次循環(huán)后,細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)熒光分子被精確定位.將這些分子的圖像合成到一張圖上,最后可以得到比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍分辨率的顯微圖像,如圖2.圖2顯示,每次只激發(fā)少數(shù)離散的熒光分子發(fā)光,并且不會(huì)產(chǎn)生空間上的重疊.不斷重復(fù)激發(fā)和探測(cè),最終可以精確地定位出足夠多的熒光分子,利用這些多幅子圖像重建出超分辨的圖像.PALM技術(shù)只能用來觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì),對(duì)于分辨細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無能為力.2006年底,美國(guó)霍華德-休斯研究所的華裔科學(xué)家莊曉薇等人開發(fā)出一種類似于PALM的方法,可以用來研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨定位.他們發(fā)現(xiàn),不同的波長(zhǎng)可以控制化學(xué)熒光分子Cy5在熒光激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間切換,例如橙色561nm的激光可以激活Cy5發(fā)射熒光,但長(zhǎng)時(shí)間照射可以將Cy5分子轉(zhuǎn)換成基態(tài)不發(fā)光.之后,用藍(lán)色的488nm激光照射Cy5分子時(shí),又可以將其從基態(tài)轉(zhuǎn)換成熒光態(tài),而此過程的長(zhǎng)短依賴于第二個(gè)熒光分子Cy3與Cy5之間的距離.因此,當(dāng)Cy3和Cy5交聯(lián)成分子對(duì)時(shí),具備了特定的激發(fā)光轉(zhuǎn)換熒光分子發(fā)射波長(zhǎng)的特性.將Cy3和Cy5分子對(duì)膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上,就可以用抗體來標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白.用特定波長(zhǎng)的激光來激活探針,然后用另一個(gè)波長(zhǎng)激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子,此過程多次循環(huán)后就可以得到內(nèi)源蛋白的高分辨率影像.他們命名該技術(shù)為STORM.PALM與STORM的分辨率僅僅受限于單分子的定位精度,理論上可以達(dá)到亞納米量級(jí),能與電子顯微鏡相媲美.但是根據(jù)奈奎斯特采樣定律,若頻帶寬度有限,要從抽樣信號(hào)中無失真地恢復(fù)原信號(hào),采樣頻率應(yīng)大于2倍信號(hào)最高頻率.因此,PALM與STORM所采樣熒光分子的空間間隔應(yīng)該要小于其分辨率的二分之一.由于每一幅子圖像只能定位一定數(shù)量的離散熒光分子,因此得到一幅高分辨率的樣品顯微圖像,需要對(duì)數(shù)萬甚至上千萬幅原始圖片進(jìn)行合成,導(dǎo)致得到一幀圖像往往需要幾小時(shí)的時(shí)間.如圖3,如果取樣精度不夠,就不能重構(gòu)出高分辨率的樣品圖像.最新的PALM顯微雖然已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)幾十秒一幀圖像的處理速度,但還是不能適用于那些要求實(shí)時(shí)觀察的活體細(xì)胞.2.2結(jié)構(gòu)照明顯微的應(yīng)用1994年德國(guó)科學(xué)家StefanHell等人提出一種受激發(fā)射損耗(STED)熒光顯微技術(shù).如圖4所示,其基本原理是用一束脈沖激發(fā)熒光分子發(fā)光的同時(shí),用另外一束空心的脈沖激光(STED激光)將第一束光斑周邊大部分的熒光分子通過受激發(fā)射損耗過程將其熒光猝滅,因此可發(fā)射熒光的區(qū)域被限制在小于衍射極限的空心區(qū)域內(nèi),從而獲得一個(gè)小于衍射極限的熒光發(fā)光點(diǎn).其強(qiáng)度半高寬從傳統(tǒng)的λ/[2nsinα]變成λ/[2nsinα√1+Ι/Ιsat]λ/[2nsinα1+I/Isat????????√],其中I是STED激光的聚焦強(qiáng)度,Isat是熒光分子的飽和吸收強(qiáng)度.由此可看出,當(dāng)I/Isat的值很大時(shí),STED成像的點(diǎn)光源可以趨于無窮小.使用特殊的不漂白的量子點(diǎn)熒光材料,目前報(bào)道的STED最高分辨率可達(dá)到6nm.但是在生物成像中,可以加載到生物樣品的激光功率是有限的,過高的激光功率會(huì)對(duì)樣品造成損傷,這是制約STED空間分辨率的主要因素.STED成像技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)變化的過程,目前可以實(shí)現(xiàn)空間分辨率62nm,每秒28幀的速度采集圖像.需要指出的是,STED是一種點(diǎn)掃描成像技術(shù),高的圖像采集速率是以犧牲光束掃描范圍來實(shí)現(xiàn)的.與寬場(chǎng)成像技術(shù)相比,點(diǎn)掃描成像一般具有較強(qiáng)的熒光漂白效應(yīng),有可能對(duì)活體生物組織帶來?yè)p傷.另外,STED系統(tǒng)光路復(fù)雜,價(jià)格非常昂貴.突破光學(xué)衍射極限遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微的另一種方法是利用結(jié)構(gòu)照明的SIM技術(shù).SIM是一種寬場(chǎng)光學(xué)顯微技術(shù),使用面陣CCD并行采集圖像,具有比STED更高的時(shí)間分辨率,與普通寬場(chǎng)顯微不同的是它還具有三維層析成像的能力.SIM的原理如圖5,顯微物鏡的空間分辨率取決于它能采集到的最大空間頻率f0,f0取決于顯微物鏡的光學(xué)傳遞函數(shù)(OpticalTransferFunction,OTF),f0=2NA/λ.當(dāng)樣品包含的高頻信息f>f0時(shí),樣品的細(xì)節(jié)將難以被分辨.如果使用空間頻率為f1的正弦條紋結(jié)構(gòu)光照明樣品,則會(huì)產(chǎn)生空間頻率為fm=|f-f1|的低頻莫爾條紋(Moiréfringes).莫爾條紋實(shí)際上是樣品與結(jié)構(gòu)光的拍頻(BeatFrequency)信號(hào),它包含有樣品超衍射分辨的高頻信息f.當(dāng)fm<f0時(shí),莫爾條紋可以在顯微物鏡下觀察到,通過軟件解碼,可以提取出樣品的超分辨信息,重組出樣品的高分辨率圖像.從頻域來看,SIM將物鏡能收集到的最大空間頻率從f0提高到了f0+f1.因此f1越大,SIM顯微的空間分辨率就越高.但是結(jié)構(gòu)照明光場(chǎng)的空間頻率f1是受衍射極限限制的,當(dāng)f1>f0時(shí),它將不能被分辨.因此,SIM顯微最大可以將光學(xué)顯微系統(tǒng)的空間分辨率提高一倍.縱向分辨率遠(yuǎn)低于橫向分辨率一直是困擾遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微的問題,結(jié)構(gòu)照明顯微還可以提高縱向分辨率.多光束干涉可以產(chǎn)生具有三維周期分布的結(jié)構(gòu)照明光場(chǎng),從而可實(shí)現(xiàn)三維空間的超分辨成像.2008年,美國(guó)Gustafsson小組使用三光束干涉SIM,成功地觀察到細(xì)胞核膜上核孔復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu),其橫向分辨率達(dá)到100nm,縱向分辨率200nm.同年,他們使用六光束干涉并結(jié)合非相干光干涉照明干涉成像顯微技術(shù)(IncoherentInterferenceIlluminationImageInterferenceMicroscopy,I5M),實(shí)現(xiàn)了縱向及橫向空間分辨率均為100nm的三維結(jié)構(gòu)照明顯微,使得從微觀上精確定位細(xì)胞內(nèi)部各種細(xì)胞器及觀測(cè)活體細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)及反應(yīng)成為可能.綜上所述,PALM和STORM是基于單分子定位的超分辨顯微成像技術(shù),需要使用特殊的熒光探針分子進(jìn)行激活/淬滅,反復(fù)迭代,最后定位,具有極高的空間分辨率,但是時(shí)間分辨率很低.STED與SIM都是基于結(jié)構(gòu)化光照明的超分辨顯微成像技術(shù),是從物理上超越衍射極限.STED的時(shí)間分辨率取決于每一個(gè)掃描點(diǎn)的停留時(shí)間,掃描步長(zhǎng),以及掃描范圍.SIM不需要掃描,每次曝光可以得到一幅完整的樣品二維光強(qiáng)分布圖像,其時(shí)間分辨率取決于結(jié)構(gòu)照明光場(chǎng)的加載速度和CCD的圖像采集速度,與其它三種超分辨顯微技術(shù)相比,SIM的空間分辨率較低,但更適用于那些需要較高時(shí)間分辨率的活體生物成像研究.2.3數(shù)字全息顯微成像原理上面介紹的熒光顯微成像方法利用光與物質(zhì)相互作用的非線性特性,可以達(dá)到很高的橫向分辨率,但是縱向分辨率仍然受到限制.對(duì)于一些不能用熒光探針分子標(biāo)記的生物樣品或材料,上述超分辨熒光顯微成像技術(shù)不能使用.數(shù)字全息顯微(DigitalHolographicMicroscopy,DHM)成像技術(shù)可以解決這個(gè)問題,成為一個(gè)重要的發(fā)展方向.數(shù)字全息顯微將光學(xué)顯微與光學(xué)全息相結(jié)合,與傳統(tǒng)的明場(chǎng)顯微技術(shù)相比,其優(yōu)勢(shì)是能三維成像,縱向分辨率可以達(dá)到1nm量級(jí),且具有自動(dòng)調(diào)焦能力,特別適合于不能用熒光探針分子標(biāo)記的透明生物樣品.數(shù)字全息顯微的特點(diǎn)是干涉記錄,數(shù)字再現(xiàn).它是傳統(tǒng)干涉顯微引入數(shù)字化技術(shù)后的發(fā)展和延伸.傳統(tǒng)的干涉顯微采用干涉的方法來記錄物光波的相位信息,并利用肉眼直接判讀干涉圖樣,是一種像面全息成像技術(shù),干涉圖樣直接反應(yīng)了被測(cè)物體的厚度或折射率分布,沒有三維成像能力.數(shù)字圖像傳感器CCD的出現(xiàn)使得全息圖的數(shù)字記錄和數(shù)字再現(xiàn)成為可能.當(dāng)采用CCD來記錄全息圖并進(jìn)行數(shù)字再現(xiàn)時(shí),干涉顯微便過渡為數(shù)字全息顯微.2.3.1數(shù)字全息顯微鏡數(shù)字全息顯微的原理如圖6(a)所示:分光棱鏡BS1將激光束分成沿正交方向傳播的兩束光.其中一束光經(jīng)過擴(kuò)束器BE擴(kuò)束準(zhǔn)直后作為參考光;另一束光用來照明樣品,被用作物光.物光被顯微物鏡MO和透鏡L1組成的望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)放大,并在分光棱鏡BS2的作用下與參考光進(jìn)行干涉,兩者的干涉圖樣被CCD記錄.從一幅載頻干涉圖樣或多幅相移干涉圖樣中可以數(shù)字再現(xiàn)出被測(cè)樣品的振幅和相位分布,其中相位分布反應(yīng)了被測(cè)物體的三維形貌或折射率分布.圖6(b)是瑞士Lunceetec公司開發(fā)的DHM-1000投射式數(shù)字全息顯微鏡;圖6(c)是該DHM拍攝的血紅細(xì)胞的三維圖像.數(shù)字全息顯微的縱向分辨率可達(dá)納米量級(jí),但橫向分辨率還主要依賴于物鏡的數(shù)值孔徑.為了突破物鏡數(shù)值孔徑對(duì)全息顯微成像橫向分辨率的限制,Mico和Schwarz等人采用不同方向的照明光依次照明樣品來記錄多幅干涉圖樣,最后將這些全息圖對(duì)應(yīng)的再現(xiàn)像進(jìn)行合成.該方法通過“合成數(shù)值孔徑”突破了顯微鏡數(shù)值孔徑對(duì)成像分辨率的限制,從而實(shí)現(xiàn)了DHM的超分辨成像.2.3.2海拉細(xì)胞中dic的分布微分干涉對(duì)比顯微(DifferentialInterferenceContrastMicroscopy,DICM)的基本原理如圖7(a):入射光被第一個(gè)渥拉斯頓棱鏡分成強(qiáng)度相等且偏振方向正交的兩束線偏振光,這兩束光經(jīng)過透鏡準(zhǔn)直后變成平行光并同時(shí)照明樣品.穿過樣品后的光波經(jīng)物鏡放大,然后在第二個(gè)渥拉斯頓棱鏡的作用下重新合在一起沿相同的方向傳播.通過檢偏器后,兩光束發(fā)生干涉.干涉圖樣反映了被測(cè)樣品在剪切方向上的相位導(dǎo)數(shù)的分布,如圖7(b).物平面上兩束平行光之間的距離對(duì)應(yīng)于微分干涉中的剪切量.通過對(duì)兩個(gè)正交方向上的相位梯度進(jìn)行積分,最終可以求出樣品的相位分布.DIC具有物參共路的光學(xué)結(jié)構(gòu),因此具有抗振動(dòng)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn).同時(shí),DIC還具有較高的空間分辨率、高的圖像對(duì)比度和光學(xué)層析能力.近年來還有許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究,如Fu等人利用光柵衍射原理,將物光的0級(jí)和+1級(jí)衍射光進(jìn)行干涉,實(shí)現(xiàn)對(duì)海拉細(xì)胞的DIC定量測(cè)量.McIntyre等人利用空間光調(diào)制器調(diào)節(jié)DIC圖像的剪切方向、剪切量和相位延遲,使之達(dá)到最佳效果,并實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)定量DIC觀測(cè).Heise和Stifter利用DIC的層析能力,觀測(cè)了油層中的粒子分布.2.3.3物光的相位:從“光暈”到“光暈”相襯干涉顯微(PhaseContrastInterferenceMicroscopy,PCIM),通過改變物光零頻分量的相位,使零頻分量與高頻分量干涉,將物光的相位信息變?yōu)閺?qiáng)度信息.如圖8(a)所示,經(jīng)過透鏡L1的傅里葉變換,含有樣品信息的物光的頻譜出現(xiàn)在透鏡L1的焦平面上.一個(gè)相位掩膜板被放置在該頻譜面上,用于延遲物光零頻分量的相位.通過第二個(gè)透鏡L2的逆傅里葉變換后,物光的相位信息變成了干涉圖的強(qiáng)度信息.圖8(b)和(c)顯示的是一個(gè)相位圓環(huán)在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和相襯顯微鏡下所成的像.美國(guó)麻省理工學(xué)院Popescu通過改變物光零頻分量的相位延遲量,得到了多幅相移干涉圖樣,實(shí)現(xiàn)了對(duì)被測(cè)樣品相位分布的定量測(cè)量.平行光照明具有橫向分辨率低、相干噪聲大的缺點(diǎn).澤尼克相襯干涉顯微鏡采用了環(huán)形照明光,如圖9(a).在顯微鏡聚光鏡的前焦面上放置一個(gè)環(huán)形光闌(CondenserAnnulus),該環(huán)形光闌上每一點(diǎn)發(fā)出的光以不同方向照明樣品.經(jīng)物鏡的傅里葉變換,物光的頻譜出現(xiàn)在物鏡的后焦平面上.環(huán)形照明光的頻譜分布仍然為一圓環(huán).照明光的零頻分量分布在圓環(huán)上,高頻分量分布在零頻分量周圍.將一相位掩模板(Phaseplate)置于此頻譜面上,用來延遲物光零頻分量的相位.該方法具有相干噪聲低、橫向分辨率高的優(yōu)點(diǎn).然而,用環(huán)狀相位掩模板來延遲圓環(huán)上零頻分量相位的同時(shí),也延遲了分布在環(huán)上的高頻分量的相位.因此,產(chǎn)生