黃體酮陰道緩釋凝膠的制備工藝與質(zhì)量控制研究

黃體酮陰道緩釋凝膠的制備工藝與質(zhì)量控制研究

黃體酮是一種天然的雌激素，在子宮內(nèi)膜的分泌、轉(zhuǎn)化、正殿和維持性周期方面發(fā)揮著重要作用。黃體酮經(jīng)各種途徑給藥均吸收迅速,但血漿t1/2僅15min,一次通過胃腸道和肝臟即大部分被破壞,故臨床應(yīng)用主要為注射劑,其特征是達(dá)峰時(shí)間迅速,但很快代謝為無活性產(chǎn)物,其不良反應(yīng)較多,大劑量使用可致肝功能障礙等。據(jù)Wyeth-Ayerst公司的臨床結(jié)果表明,黃體酮陰道緩釋凝膠(商品名:Crinone)局部應(yīng)用后,孕激素相關(guān)的不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯降低,相對(duì)注射會(huì)造成患者注射部位疼痛,甚至臀部板結(jié),本制劑更易使患者接受。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn),研制了黃體酮陰道用緩釋凝膠,并對(duì)其質(zhì)量控制方法進(jìn)行了考察。處方中的聚卡波非具有較強(qiáng)的生物黏附性,它類似仿生的帶陰性電荷的黏蛋白,是一種難溶于水的多聚物,可黏附在陰道上皮細(xì)胞上,同時(shí)具有良好的溶脹性。聚卡波非及卡波姆為弱酸,具有良好的緩沖能力,保持了陰道中酸性環(huán)境所載藥物的持續(xù)釋放。本制劑為水包油乳劑型,黃體激素小部分溶于賦型劑的水相和油相中,多數(shù)的黃體激素則以懸浮狀態(tài)存在。1材料表面1.1試驗(yàn)儀器和試劑100-2型膠體磨(溫州市江南機(jī)械廠);BH-200型高速攪碎機(jī)(江蘇江陰科研器械廠);微孔濾膜(0.8μm,MilliporeCo.,Bedford,MA);ZRD6-B藥物溶出度儀(上海黃海藥檢儀器廠);聚四氟乙烯樣品池(自制);高效液相色譜儀(日本島津LC-10ATVP);NDJ-1旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)(上海衡平儀器儀表廠);黃體酮對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):0027-9606);Crinone凝膠(ColumbiaLaboratories,Inc);微粉化黃體酮(湖北制藥廠);聚卡波菲、卡波普974P(BFGoodrichCo.);混合酸甘油酯(黑龍江鐵力制藥廠);液狀石蠟(藥用,哈爾濱化工化學(xué)試劑廠);十二烷基硫酸鈉(分析純,沈陽化學(xué)試劑廠);其他為分析純?cè)噭?.2黃體酮緩沖液的制備和配方的篩選1.2.1聚合物的制備①聚合相(水相)的制備:將配方量的山梨酸溶于水中,然后將聚卡波菲和卡波姆974P在攪拌條件下分批加入水溶液中,常溫下攪拌1.5h左右,得均勻膠狀聚合物,加氫氧化鈉調(diào)pH值得均質(zhì)混懸膠液,再加入黃體酮,攪拌均勻。②油相的制備:將混合酸甘油酯、液體石蠟、甘油熔融,混合均勻,冷卻至55℃。③緩釋凝膠的制備:將①制得的均質(zhì)混懸膠液加熱至55℃,同時(shí)將55℃的油相在攪拌條件下分批加入均質(zhì)混懸膠液中,攪拌均勻,得含有黃體酮緩釋凝膠。1.2.2凝膠的結(jié)構(gòu)變化分別采用不同的處方與工藝制備凝膠,以黏度與釋放度為指標(biāo),篩選處方與工藝。本制劑為水包油乳劑型凝膠,在處方篩選過程中,我們考察了聚合相(水相)和油相用量的改變對(duì)緩釋凝膠的體外釋放和黏度的影響。凝膠黏度的測(cè)定用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定,對(duì)于不同處方的凝膠制劑分別測(cè)定了20和37℃時(shí)的黏度。聚卡波菲為影響緩釋凝膠的外觀性狀黏度和釋放速度的主要影響因素,因此其濃度的變化影響藥物的性質(zhì)。我們選擇了3種濃度,分別為0.5%,1.5%,3.0%。其他組份不變,3個(gè)處方即處方1,處方2,處方3。油相也是影響緩釋凝膠的外觀性狀、黏度和釋放速度的主要因素之一,因此在處方篩選時(shí)與國外處方相比較,也相應(yīng)的增加一倍和減少了一倍油相的用量,而其他組份不變的兩個(gè)處方,即處方4、處方5。各處方組成見表1。1.2.3乳化溫度的確定凝膠水合時(shí)間的長短可能會(huì)影響藥物的釋放速度及凝膠的其他質(zhì)量指標(biāo),因此選擇了水合0.5,1.5和3h的3個(gè)工藝,即工藝1、工藝2、工藝3。乳化時(shí)的溫度可能會(huì)對(duì)制劑質(zhì)量有影響;本品處方中混和酸甘油酯常在40℃以下為固體,需在55℃以上,能夠徹底熔融,因此選擇55℃做為乳化溫度。考慮工業(yè)化生產(chǎn)的需要,篩選均漿法及膠體磨均質(zhì)法。即工藝4、工藝5。1.3黃體酮緩沖凝膠的質(zhì)量控制方法研究1.3.1測(cè)定總體規(guī)劃液及檢出液制備①色譜條件:色譜柱:C18柱Diamonsi(Tm)鉆石5μm;流動(dòng)相:甲醇-水(75∶25);流速:1.2mL·min-1;柱溫:室溫;檢測(cè)波長:254nm;進(jìn)樣量:20μL;柱效:以黃體酮峰計(jì),理論塔板數(shù)不低于2500。②對(duì)照品溶液的配制:精密稱取黃體酮對(duì)照品適量,加甲醇制成每1mL含黃體酮250μg溶液,作為對(duì)照品溶液。③內(nèi)標(biāo)溶液的配制:精密稱取己烯雌酚適量,加甲醇制成每1mL含己烯雌酚250μg的溶液,作為內(nèi)標(biāo)溶液。精密量取對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各2mL置于10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,20μL進(jìn)樣。④供試品溶液的配制:精密稱取本品適量(約相當(dāng)于黃體酮12.5mg)置于50mL量瓶中,加甲醇適量,超聲溶解后,再加甲醇至刻度,過濾,精密量取該樣品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各2mL置10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,取20μL注入液相色譜儀。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算。并進(jìn)行線性關(guān)系與方法學(xué)考察。1.3.2不同孔徑微生物濾膜對(duì)釋放度的影響本實(shí)驗(yàn)根據(jù)歐洲藥典和相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了聚四氟乙烯樣品池用于本品的釋放度測(cè)定。釋放度測(cè)定條件的篩選:將過量的黃體酮原料藥加入不同溶劑[30%異丙醇,0.5%十二烷基硫酸鈉,0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液(pH4.0)溶液]中,于(37±0.5)℃恒溫振蕩48h,樣品用0.45μm微孔濾膜過濾,用甲醇稀釋后采用HPLC測(cè)定藥物濃度。分別選擇不同孔徑(0.45,0.8,3.0μm)的微孔濾膜作為支持膜,測(cè)定釋放度。測(cè)定方法如下:將釋放介質(zhì)溶液900mL加入溶出杯內(nèi),轉(zhuǎn)速為50r·min-1,預(yù)溫至(37±0.5)℃,取本品適量約相當(dāng)于單劑量的重量置于樣品池中,精密稱定,在樣品表面覆蓋微孔濾膜,再依次放置硅橡膠墊圈和聚四氟乙烯墊圈,并用螺栓固定,放入燒杯下部,開始攪拌。定時(shí)取溶液5mL,用0.45μm微孔濾膜濾過,并及時(shí)往溶出杯內(nèi)補(bǔ)充等體積的空白釋放介質(zhì),取續(xù)濾液作為供試品溶液。照液相色譜條件測(cè)定,計(jì)算出不同時(shí)間的釋放量。并進(jìn)行方法學(xué)考察。1.3.3試驗(yàn)方法黃體酮光破壞樣品的制備:將黃體酮原料藥平鋪在小平皿內(nèi)(<5mm)在距離碘鎢燈15～20cm處照射8h后,精密稱取,甲醇配成10g·L-1的溶液。黃體酮堿破壞樣品的制備:①熔點(diǎn)加堿破壞方法:將黃體酮原料藥置于小燒杯中,加入飽和NaOH溶液數(shù)滴,置于烘箱內(nèi),在其達(dá)熔點(diǎn)溫度128℃、2～3min時(shí)取出,精密稱取,甲醇配成10g·L-1溶液。②水浴回流堿破壞方法:稱取黃體酮0.5g,置于圓底燒瓶中,加50mL甲醇,5滴飽和氫氧化鈉溶液,水浴回流6h,相當(dāng)于10g·L-1的溶液。測(cè)試方法:取本品加甲醇制成每1mL中含10mg的溶液,作為供試品溶液;再分別精密稱取適量,加甲醇稀釋成每1mL中含0.1,0.15,0.3mg的溶液,作為對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000年版二部附錄ⅤB)實(shí)驗(yàn),吸取供試品溶液與對(duì)照溶液10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以氯仿-乙酸乙酯(66∶33)為展開劑,展開后,涼干,置紫外光燈(254nm)下檢視,供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn),除Rf<0.18的點(diǎn)外不得多于3個(gè),其顏色與對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)比較,不得更深(<3.0%)。取3批樣品,進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查。2結(jié)果2.1黃體酮緩沖液的制備工藝篩選2.1.1黃體酮緩沖凝膠的處方選擇幾個(gè)典型處方的黏度測(cè)定和體外釋放結(jié)果見表2和圖1。2.1.2凝膠流變學(xué)的測(cè)定制備工藝的篩選測(cè)定結(jié)果見表3,圖2。由表2,3,圖1,2結(jié)果可見,從黏度測(cè)定結(jié)果看,溫度升高,黏度增大。黏度計(jì)轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速增加,凝膠的黏度下降。這種剪切變稀的流變學(xué)性質(zhì)有利于凝膠制備過程的填裝和給藥。綜合凝膠的黏度、藥物的釋放性質(zhì)等因素,黃體酮緩釋凝膠的組成為處方2及按工藝2制備時(shí)較為合理。根據(jù)“2.1.1”,“2.1.2”處方及工藝條件制備的樣品,對(duì)其48h內(nèi)藥物的釋放度與國外樣品比較,體外藥物釋放度無明顯差別,結(jié)果見圖3。2.2黃體酮緩沖凝膠的質(zhì)量控制方法研究2.2.1黃體酮與己烯成蟲對(duì)照品甲醇溶液的制備方法專屬性與最小檢出量考察:①以高效液相色譜法測(cè)定黃體酮,選用C18色譜柱和反相流動(dòng)相分離體系紫外光譜檢測(cè)器檢測(cè),本品有特征色譜保留時(shí)間和特征波長,輔料與溶劑無干擾,見圖4。黃體酮的最小檢出量為0.45μg。②含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取黃體酮、已烯雌酚分別配置一系列濃度的黃體酮、己烯雌酚為內(nèi)標(biāo)的對(duì)照品甲醇溶液。按含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定,以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線:ρ=60.9922A-0.3879,r=0.9999(n=5),線性范圍17～85mg·L-1。③精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào):001107),按含量測(cè)定方法連續(xù)進(jìn)樣6次,精密度的RSD=0.67%;取同一批樣品(批號(hào):001107),按含量測(cè)定方法,重復(fù)測(cè)定6次,得含量平均值為標(biāo)示量的101.8%,RSD=0.63%。④回收率測(cè)定:精密稱取不同量的黃體酮對(duì)照品,加入相應(yīng)處方量的輔料,照含量測(cè)定方法測(cè)定。由測(cè)得量和加入量計(jì)算回收率為(102.33±1.01)%(n=9)。⑤樣品的含量測(cè)定:3批樣品(批號(hào):001106,001107,001108)含量測(cè)定結(jié)果為99.8%,101.8%,105.5%,符合要求。2.2.2半固體制劑體外釋放度測(cè)試方法①溶出介質(zhì)的選擇:黃體酮為水不溶性藥物,水中溶解度為13.2mg·L-1,為滿足藥物釋放過程中符合漏槽條件,通常加入少量表面活性劑或有機(jī)溶劑(乙醇,異丙醇等)增加釋放度溶劑中藥物的溶解度。黃體酮在30%異丙醇,0.5%十二烷基硫酸鈉水溶液和0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液(pH4.0)溶液中的溶解度分別為1938,841.5和676.6mg·L-1,釋放溶劑的容積為500mL以上時(shí)能夠保證藥物釋放過程中的漏槽條件。本實(shí)驗(yàn)選擇0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液(pH4.0)溶液作為釋放溶劑。②膜的選擇:選擇適當(dāng)?shù)谋∧な墙牍腆w制劑體外釋放度測(cè)試方法的關(guān)鍵,常用的支撐膜包括透析紙、微孔濾膜等不同孔徑的人工合成薄膜,用不同孔徑的微孔濾膜(0.45,0.8,3.0μm)作為支持膜的釋放度。結(jié)果表明,濾膜孔徑大小對(duì)藥物釋放速率影響不明顯。由于孔徑過大有部分凝膠基質(zhì)過濾膜進(jìn)入釋放溶劑,造成溶液過濾困難,因此選擇孔徑0.8μm的微孔濾膜作為釋放度測(cè)試實(shí)驗(yàn)的支持膜。③測(cè)定方法:黃體酮在254nm左右有最大吸收,參照“1.3.1”項(xiàng)下方法,測(cè)定黃體酮的濃度。溶劑無干擾。由于每次取樣體積較少故采用了外標(biāo)法測(cè)定釋放介質(zhì)中黃體酮的濃度。④標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取黃體酮對(duì)照品適量,加甲醇溶解并定量稀釋制成不同質(zhì)量濃度的黃體酮對(duì)照品溶液,分別吸取20μL進(jìn)樣。經(jīng)回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線為ρ=1977407.643A-12526.2365,r=0.9998(n=5),線性范圍0.3～64mg·L-1。⑤回收率測(cè)定:根據(jù)工藝考察資料結(jié)果,黃體酮凝膠72h在溶出介質(zhì)中溶出量大約在50%～60%。精密稱取黃體酮適量,加入釋放介質(zhì)溶解并定量稀釋制成相當(dāng)于10%～60%的釋放量黃體酮深度樣品溶液,分別吸取20μL進(jìn)樣,以測(cè)得量和加入量計(jì)算其回收率為(101.4±1.18)%(n=6)。⑥重復(fù)性實(shí)驗(yàn):稱取黃體酮,用溶出介質(zhì)定量溶解,制成黃體酮溶液于不同時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣,測(cè)定其HPLC的峰面積,計(jì)算不同時(shí)間(2,4,6,8,12h)的含量變化。測(cè)得不同時(shí)間的平均含量為115.7%,RSD為0.69%,表明在12h內(nèi)樣品的含量穩(wěn)定,重復(fù)性良好。⑦緩釋凝膠體外釋放實(shí)驗(yàn):3批樣品釋放度測(cè)定結(jié)果及一批樣品釋放均一性測(cè)定結(jié)果表明,同一批號(hào)樣品釋放度數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差比較小,體外釋放度測(cè)定方法重現(xiàn)性好,3批自制樣品以及國外樣品的釋放度差別不大。2.2.3黃體酮與降解產(chǎn)物分離度的測(cè)定方法的可行性實(shí)驗(yàn):將黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品,光及堿破壞樣品,照薄層色譜法點(diǎn)樣(《中國藥典》2005年版二部),照“1.3.3”項(xiàng)下的測(cè)定方法進(jìn)行檢查,結(jié)果見圖5?？梢婞S體酮與降解產(chǎn)物分離度較好,靈敏度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明,可檢出質(zhì)量濃度為0.05g·L-1。樣品的有關(guān)物質(zhì)檢查:3批樣品(批號(hào):001106,001107,001108)檢查結(jié)果顯示,相關(guān)物質(zhì)含量均符合要求。3黃體酮緩釋凝膠的體外釋放度測(cè)定3.1國外制劑處方中采用了氫化棕櫚酸甘油酯作為油相的組分,基于國內(nèi)沒有氫化棕櫚酸甘油酯,在處方研究中選用理化性質(zhì)相似的混合酸甘油酯進(jìn)行了替代研究,并對(duì)處方組成比例進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)得到的制劑與國外制劑基本一致。另外對(duì)工藝進(jìn)行了研究,使之適合工業(yè)化生產(chǎn)的需要。3.2以0.5%十二烷基硫酸鈉水溶液或30%異丙醇為釋放溶劑,雖然能滿足釋放度測(cè)定的漏槽條件,但由于凝膠吸收大量溶劑而發(fā)生溶脹,為保證體內(nèi)外釋放條件盡可能接近,選擇0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液(pH4.0)溶液為釋放溶劑。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,處方中聚卡波菲和液體石蠟的含量對(duì)凝膠的黏度有明顯影響,而制備工藝對(duì)產(chǎn)品黏度的影響不大。凝膠中聚卡波菲和油相的用量在一定范圍內(nèi)對(duì)藥物的釋放度影響不大,凝膠的混合方法和水合時(shí)間對(duì)藥物釋放無明顯影響,用勻漿機(jī)混合所得凝膠的黏度較大,而且樣品的均勻、細(xì)膩性較過膠體磨的凝膠差。3.4本品為陰道用凝膠制劑,pH值在3～4左右,與正常生理狀態(tài)下陰道黏液的pH值一致,在此pH條件,凝膠基質(zhì)中卡波姆和聚卡波菲的羧基為游離狀態(tài),生物黏附作用強(qiáng),