下載本文檔
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
青蒿素對蓮花隱桿線蟲生殖的影響
[通信作者]陳根,電子郵件:chengen。1材料表面1.1麻黃埃希菌尿丙烯酰胺啶滲突變型秀麗隱桿線蟲(N2野生型)和OP50(尿嘧啶滲漏突變型)大腸埃希菌由美國線蟲中心(CaenorhabditisGeneticsCenter)惠贈(zèng)。1.2pcr擴(kuò)增dh2po4-kh2po4/抓清劑/培養(yǎng)基溶劑配方1000ml培養(yǎng)基NGM中含3gNaCl,2.5g蛋白胨,17g瓊脂,25mlk2HPO4-KH2PO4緩沖液(1mol/L),pH6.0,975mlddH2O,滅菌后加入抽濾除菌的1ml膽固醇溶液,1ml1mol/LMgSO4和1ml1mol/LCaCl2。2方法2.1沖下培養(yǎng)基內(nèi)的l4期成蟲用M9緩沖液(每升含15.12gNa2HPO4·12H2O,3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4·7H2O,0.12gMgSO4)沖下培養(yǎng)基中的L4期成蟲。取3.5ml至離心管中,加堿裂解液(0.4g/mlNaOH與NaClO體積比為1︰2)至4ml,每隔2min震蕩1次,約10min后,懸濁液變澄清,4000r/min(離心半徑11.0cm)離心1min,用ddH2O漂洗2次后置于無菌NGM培養(yǎng)基上孵化過夜。2.2青蒿素的生長試驗(yàn)分青蒿素(美國Adams試劑公司產(chǎn)品)3、4、5mmol/L和對照組(0mmol/L)。將不同濃度的青蒿素加入NGM培養(yǎng)基中,接種OP50,37℃孵育過夜。挑取20條同步化后的L4期線蟲入各實(shí)驗(yàn)組,25℃培育,每隔24h計(jì)數(shù),每隔2d換一次培養(yǎng)皿。采用one-wayANOVA分析方法,使用SPSS11.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2.3rna的提取取約500條5mmol/L組剛進(jìn)入成蟲期的秀麗隱桿線蟲,用M9緩沖液沖洗3次,或者用ddH2O在4℃沉降1h,1500r/min(離心半徑11.0cm)離心3min,去上清,將蟲體轉(zhuǎn)移至無RNA酶的Ep管中,用trizol法提取RNA。提取的RNA用20μl無RNase水溶解,-20℃保存。2.4引物的設(shè)計(jì)與合成將得到的總RNA使用Takara公司PrimeScriptRTMasterMix試劑盒,反轉(zhuǎn)錄得到線蟲的cDNA。反應(yīng)體系(10μl):5×PrimeScriptBuffer2μl,線蟲RNA1μl,加RNasefree的水至10μl。PCR反應(yīng)37℃反轉(zhuǎn)錄15min,反轉(zhuǎn)錄酶85℃失活5s,4℃保存。參照GenBank,利用Primer軟件,設(shè)計(jì)ama-1、ung-1、sec-23和lin-29的引物,其中ama-1為管家基因。引物由日本Takara公司合成?;蛞镄蛄幸姳?。Real-timeRT-PCR是采用SYBRGreenⅠ方法,使用SYBRPremixExTaqⅡ(Takara)試劑盒,儀器為RocheLightCycler480(RocheAppliedScience)。反應(yīng)體系(20μl):模板2μl,上、下游引物各0.8μl(10μmol/L),SYBRPremixExTaq10μl,加去離子水至20μl。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性5min;95℃變性10s,61℃退火30s,72℃延伸10s,共40個(gè)循環(huán);遵照△△ct法,使用羅氏分析軟件進(jìn)行分析(Rocheappliedscience)。結(jié)果1秀麗隱桿線蟲的生殖3、4和5mmol/L青蒿素對秀麗隱桿線蟲的生殖有一定影響,在體視顯微鏡下未觀察到有卵產(chǎn)生或者幼蟲,但2、1mmol/L或更低濃度時(shí),秀麗隱桿線蟲的生殖無明顯影響,致死率也較低。故以5mmol/L青蒿素處理的蟲株提取的總RNA與正常對照組。由圖1可知3、4、5mmol/L青蒿素組秀麗桿菌線蟲平均生存天數(shù)為3.65、3.25和2.65d,與正常對照組4.3d比較均有一定程度的降低。2rna的運(yùn)用提取的秀麗隱桿線蟲RNA1%瓊脂糖電泳結(jié)果見圖2。RNA為3條帶,從上至下分別為28S、18S和5S。樣品經(jīng)核酸定量儀ThermoNanodropND-2000C檢測,A260/A280值1.9~2.0。3熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線分別將處理過的樣品和對照品按照20μl體系配制,ama-1作為管家基因,在RocheLightCycler480熒光定量儀上進(jìn)行擴(kuò)增,得到平行反應(yīng)擴(kuò)增過程的S型熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線(圖3)。所有曲線拐點(diǎn)清楚,指數(shù)增長期明顯。曲線指數(shù)期擴(kuò)增斜率大,說明擴(kuò)增效率高。復(fù)孔重復(fù)性高。4個(gè)基因的溶解曲線主峰位置重疊,窄且尖,無雜峰,引物特異性較好(圖4)。4pcr擴(kuò)增長度結(jié)果見圖5。M泳道為Marker,1~4泳道為lin-29PCR產(chǎn)物長度為129bp,5~8泳道為sec-23PCR產(chǎn)物長度為108bp,9~12泳道為ung-1PCR產(chǎn)物長度為86bp。5基因組織調(diào)節(jié)型處理組與對照組相比,ung-1和lin-29基因表達(dá)上調(diào),sec-23基因表達(dá)下調(diào)。由此可以得出ung-1、lin-29和sec-23在線蟲的生殖與發(fā)育過程中均參與調(diào)節(jié)作用,并且ung-1和lin-29表達(dá)上調(diào),sec-23表達(dá)下調(diào)(P<0.05)(圖6)。6蟲體幼蟲wrms在5mmol/L青蒿素組發(fā)現(xiàn)由頭到尾充滿線蟲蟲體的幼蟲,稱為“bagofworms”(圖7)??赡苁撬幬飳€蟲的外生殖器產(chǎn)生作用,導(dǎo)致蟲卵難以排出或者影響了線蟲的神經(jīng)調(diào)節(jié)而出現(xiàn)的現(xiàn)象。青蒿素對秀麗隱桿線蟲生殖的影響青蒿素的烷基化作用是青蒿素的抗瘧機(jī)制之一。新的酯類化合物抗瘧效價(jià)更高。青蒿素可使紅細(xì)胞中H2O2和O2等活性氧的濃度升高,并能增加紅細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化,從而可直接殺傷瘧原蟲,其氧化產(chǎn)物也可直接作用于瘧原蟲,使紅細(xì)胞損傷、破溶而導(dǎo)致瘧原蟲死亡。青蒿素類藥物有抗血吸蟲作用,在整個(gè)服藥階段均可殺滅幼蟲期血吸蟲。青蒿素還能殺滅進(jìn)入宿主體內(nèi)的幼蟲;對疫水接觸者具有保護(hù)作用;用于感染日本血吸蟲尾蚴后的早期治療,可降低血吸蟲感染率和感染程度,并可預(yù)防血吸蟲病的發(fā)生。青蒿素抗血吸蟲活性基團(tuán)是過氧橋,青蒿素作用機(jī)理是影響糖的代謝。研究發(fā)現(xiàn),肝期血吸蟲經(jīng)青蒿素的衍生物蒿甲醚作用后糖元減少,堿性磷酸酶活力受到抑制。體表腸管和生殖腺明顯退行性變,蟲體變細(xì),蛋白質(zhì)含量明顯減少,尤以雌蟲更明顯。本研究用3、4、5mmol/L青蒿素處理秀麗隱桿線蟲,均可縮短線蟲的壽命,并能完全抑制線蟲的繁殖。研究表明lin-29在幼蟲的第一階段被檢測到并且從開始到最后蛻皮階段顯著增加,說明lin-29的表達(dá)是線蟲終末分化所必須的條件。let-23編碼的蛋白是表皮生長因子受體家族的跨膜絡(luò)氨酸激酶,主要涉及到秀麗隱桿線蟲的外陰發(fā)育。UNG-1蛋白是一種活化的尿嘧啶-DNA糖基化酶,在細(xì)胞內(nèi)有助于修復(fù)電離輻射誘導(dǎo)的DNA堿基損傷。Desalermos等發(fā)現(xiàn)用5-氟尿嘧啶(5-Fu)處理過的線蟲lin-29與let-23表達(dá)均為上調(diào),并且濃度越高,上調(diào)的幅度越大。Kim等證明5-Fu能抑制線蟲的生殖率并能介導(dǎo)線蟲精細(xì)胞的死亡,Dengg等也證明dUTPase的消耗導(dǎo)致尿嘧啶的升高,干擾線蟲的性腺、生殖器的發(fā)育和形成。線蟲的排卵和神經(jīng)調(diào)節(jié)也有一定的作用。5-Fu有損傷DNA的作用,通過DNA損傷反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡,因?yàn)?-Fu在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有抑制TGF-β的作用。在青蒿素及其衍生物中也觀察到類似的想象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示sec-23表達(dá)下調(diào),lin-29與ung-1表達(dá)均上調(diào),其中l(wèi)in-29的上調(diào)與文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由此判斷青蒿素對秀麗桿菌線蟲生殖
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 學(xué)生托管合同范本
- 共同配送合同范本
- 《創(chuàng)傷性顱腦損傷早期康復(fù)環(huán)境護(hù)理模式的構(gòu)建及其實(shí)驗(yàn)研究》
- 《柔韌性與僵硬性扁平足女大學(xué)生行走和跳躍落地時(shí)下肢生物力學(xué)特征的研究》
- 黑豬訂購合同范本
- 裝飾材料合同范本
- 《腎功能與血脂異常關(guān)系的隊(duì)列研究》
- 《我國醫(yī)療損害賠償法律制度研究》
- 京東商城合同范本
- 《黑龍江省乳制品質(zhì)量監(jiān)管問題研究》
- 第五單元測試卷(單元測試)-2024-2025學(xué)年六年級(jí)上冊語文統(tǒng)編版
- 國開2024年秋《機(jī)械制圖》形考作業(yè)1-4答案
- 船長常規(guī)命令
- 申請建立XX康復(fù)醫(yī)院的可行性報(bào)告
- 幼兒園工程監(jiān)理工作總結(jié)-監(jiān)理工程的工作總結(jié).doc
- 高等學(xué)校學(xué)生食堂伙食結(jié)構(gòu)及成本核算指導(dǎo)意見
- 正交分解法教學(xué)設(shè)計(jì)
- 露天采石場開采方案
- 橋梁常見病害原因及技術(shù)處理方法
- 甲狀腺癌 教學(xué)課件
- 客房部計(jì)劃衛(wèi)生表
評論
0/150
提交評論