實(shí)時(shí)熒光定量PCR注意事項(xiàng)及原理(Q-RT)

Quantitativereal-timePCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR一、概述二、實(shí)驗(yàn)流程三、數(shù)據(jù)分析*四、疑難解答*一、概述常規(guī)PCR概念：擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)是通過終點(diǎn)法來分析檢測，即PCR結(jié)束后，DNA通過瓊脂凝膠電泳，然后進(jìn)行成像分析。局限性：無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析;對(duì)終產(chǎn)物分析，受PCR過程平臺(tái)效應(yīng)的干擾，定量準(zhǔn)確度難以提高(相對(duì)誤差>1000%);存在擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問題；必須在擴(kuò)增后用電泳方法進(jìn)行分析，耗時(shí)費(fèi)力而且EB有毒。無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR概念：在反應(yīng)體系中加入熒光分子，利用熒光信號(hào)的按比例增加來反應(yīng)DNA量的增加，實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR過程。主要優(yōu)點(diǎn)：能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程;能夠精確測定每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增片段數(shù)量，從而對(duì)樣本中的起始材料量進(jìn)行準(zhǔn)確定量;具有更大的檢測動(dòng)態(tài)范圍;在單管中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和檢測，無需PCR后處理?？梢杂糜诙ㄐ?判斷一段序列的有無)，也可用于定量(確定DNA拷貝數(shù)).熒光報(bào)告基團(tuán):雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料：SYBRGreenI，非特異性結(jié)合在游離狀態(tài)下,SYBR?Green?I發(fā)出微弱的熒光,但一旦與dsDNA結(jié)合,其熒光增加1000倍。工作原理:x-軸表示PCR循環(huán)數(shù)；y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值,與反應(yīng)管中擴(kuò)增產(chǎn)物的量有比例關(guān)系(28-40個(gè)循環(huán))(1-18個(gè)循環(huán))初始循環(huán)數(shù)閾值二、實(shí)驗(yàn)流程ExperimentalprocedureRNA樣品的質(zhì)量控制1.純度檢測：OD260/280分光光度法—是否有蛋白污染？比值在1.8~2.0之間則表示該RNA質(zhì)量好，無蛋白和苯酚的污染。

2.完整性檢測：瓊脂糖凝膠電泳檢測大分子量的條帶亮度是小分量的約2倍則表示RNA完整的。Marker28s(核糖體RNA)18s(rRNA)用模板初始量（或未知量樣品的稀釋倍數(shù)）的log值對(duì)每個(gè)稀釋品的CT值作圖，兩者呈線性遞減的關(guān)系，稱之為標(biāo)準(zhǔn)曲線（至少5個(gè)數(shù)量級(jí)）。用來判定SYBRGreen?I反應(yīng)的效率、重復(fù)性和動(dòng)態(tài)范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，則熒光曲線之間的間距公式：

2n=稀釋倍數(shù)

“n”

為閾值線上擴(kuò)增曲線之間的循環(huán)數(shù)，稱為CT的差異。例如，10倍稀釋的DNA樣品，2n=10，n=log210=3.32，即CT值相差3.32個(gè)循環(huán)。[用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板濃度范圍必須涵蓋所有待測樣本模板濃度]n

R2顯示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合回歸曲線的程度，即數(shù)據(jù)的線性化程度。

檢測重復(fù)樣品數(shù)據(jù)是否一致和不同拷貝數(shù)的初始模板是否具有相同的擴(kuò)增效率。優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)曲線：R2>0.980擴(kuò)增效率E應(yīng)在90–110%之間。E=10-1/斜率y=-3.301x+38.591實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的部分實(shí)施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。三、數(shù)據(jù)分析絕對(duì)定量相對(duì)定量絕對(duì)定量是測定靶點(diǎn)實(shí)際拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析方法。需對(duì)已知濃度的目標(biāo)模板溶液進(jìn)行幾次連續(xù)稀釋，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，利用獲得的數(shù)據(jù)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將未知樣本的Ct值與此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，確定其拷貝數(shù)。

絕對(duì)定量例如：

10倍稀釋已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

得

y=-3.301x+38.591

或

CT=-3.301(logquantity)+38.591

未知樣品的量

Quantity=10(CT-38.591)/-3.301在相對(duì)定量中，通過歸一化來確保相等數(shù)量的樣品中比較目標(biāo)基因的量。常用的是選擇一個(gè)參照基因(如GAPDH，β-actin等)來進(jìn)行相對(duì)定量，目的是彌補(bǔ)樣本組織量的差異。用相對(duì)定量比較多個(gè)試驗(yàn)樣本(test)，樣本之一常被選為參照作為校準(zhǔn)樣品(calibrator)，所有樣本中目標(biāo)基因的表達(dá)都相對(duì)于參照上調(diào)或下調(diào)，無需精確測定拷貝數(shù)，而是關(guān)注與校準(zhǔn)樣本相比的倍數(shù)變化。相對(duì)定量例如，研究某一小麥基因在種子中的表達(dá)水平，取開花后5個(gè)時(shí)期樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板的制備內(nèi)參基因標(biāo)曲目標(biāo)基因標(biāo)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線E在90–110%之間，R2>0.980，滿足分析條件。用參照基因進(jìn)行相對(duì)定量的方法有3種：1)Livak法，即2-△△Ct法;2)用參照基因的△Ct;3)Pfaffl法1)Livak法，即2-△△Ct法條件：目標(biāo)基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)。

首先，用內(nèi)參基因的Ct值歸一目標(biāo)基因的Ct值，

△Ct(test)=

Ct(target，test)-

Ct(ref，test)△Ct(calibrator)=

Ct(target，calibrator)-

Ct(ref，calibrator)其次，用校準(zhǔn)樣本的△Ct值歸一試驗(yàn)樣本的△Ct值，

△

△Ct=

△Ct(test)-△Ct(calibrator)

最后，計(jì)算表達(dá)水平比率，

2-△△Ct=表達(dá)量的比值分析：得到的結(jié)果是通過內(nèi)參基因表達(dá)水平校準(zhǔn)的試驗(yàn)樣本中目標(biāo)基因相對(duì)于校準(zhǔn)樣品的增加或減少的倍數(shù)。校準(zhǔn)樣品的表達(dá)水平相當(dāng)于“1”?！鰿t(calibrator)=△Ct(15d)=

Ct(target，15d)-

Ct(ref，15d)

=25.42-20.39=5.03△Ct(test)=

△Ct(10d)=

Ct(target，10d)-

Ct(ref，10d)

=28.55-22.72=5.83△

△Ct=△Ct(test)-

△Ct(calibrator)=

△Ct(10d)-

△Ct(15d)=

5.83-5.03=0.8表達(dá)量的比值=2-△△Ct=2-0.8=0.574352)用參照基因的△Ct是2-△△Ct法的一種變形，校準(zhǔn)樣品的表達(dá)水平不是“1”。

首先，對(duì)所有樣品的目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化，表達(dá)=2(Ct(ref)-Ct(target))

若分析兩個(gè)樣本的比值(試驗(yàn)樣品/校準(zhǔn)樣品)，則得到與2-△△Ct法一樣的結(jié)果。10d樣品：2(Ct(ref)-Ct(target))=2(22.72-28.55)=0.0175715d樣品：2(Ct(ref)-Ct(target))=2(20.39-25.42)=0.0306915d表達(dá)=0.03069/0.03069=110d表達(dá)=0.01757/0.03069=0.572413)Pfaffl法

適用于目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增效率不同，但目標(biāo)和參照基因在試驗(yàn)樣品和校準(zhǔn)樣品中有相同的擴(kuò)增效率。

(Etarget)△Ct，target(calibrator-test)Ratio=

(Eref)△Ct，target(calibrator-test)四、疑難解答引物二聚體的形成當(dāng)兩個(gè)PCR引物(同義引物或正義和反義引物)相互結(jié)合，而非與靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)，即形成引物二聚體。根據(jù)長度的不同，引物也可能出現(xiàn)自身折疊，由此與模板形成沖突。DNA結(jié)合染料的結(jié)合方式為非特異性的，由此可導(dǎo)致反應(yīng)過程中監(jiān)測到的熒光信號(hào)增強(qiáng)。這可相應(yīng)改變Ct值，使結(jié)果出現(xiàn)偏差。

A1:

凝膠電泳是可顯示引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位于100bp以下。在PCR過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。缺點(diǎn)：其靈敏度最低僅達(dá)到納克級(jí)，因此可能無法得出結(jié)果。A2:

采用熔解曲線分析可鑒別是否存在引物二聚體。如果擴(kuò)增具有極好的特異性，則實(shí)時(shí)熒光定量PCR板上每個(gè)反應(yīng)孔的解離曲線將出現(xiàn)一個(gè)較窄的單峰。

引物二聚體的熔解溫度較擴(kuò)增片段更低，在70°C左右熔解。出現(xiàn)此峰形和熔解溫度主要是由于引物二聚體的長度較小且不確定。

NTC樣品濃度低樣品濃度高如果引物二聚體只是在NTC孔里出現(xiàn)，或者樣本孔和NTC孔的ΔCt值的差異是大于10，來自引物二聚體的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì)。

A3:

優(yōu)化熱循環(huán)條件，提高退火溫度，減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體。A4:

可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為200nM，但如有需要，可將濃度降至60nM。A5:

如果未對(duì)引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評(píng)估，則應(yīng)補(bǔ)充評(píng)估并考慮重新設(shè)計(jì)。NTC擴(kuò)增當(dāng)引物二聚體形成時(shí)，如果使用與DNA雙鏈結(jié)合的染料，在NTC反應(yīng)中也可觀察到熒光信號(hào)。另一種情況，在存在污染物的情況下，在NTC孔中也可看到晚期擴(kuò)增。如果由于加樣錯(cuò)誤引起是一種隨機(jī)事件，并不是所有NTC都會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增。如果在每一個(gè)NTC反應(yīng)里都出現(xiàn)擴(kuò)增，很可能是其中一種或兩種試劑被污染了。

A1:

使用干凈的工作臺(tái)，用帶核酸降解試劑的的溶液擦抹工作臺(tái)面。A2:

用新的反應(yīng)管盡量通過置換不同來源的試劑，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)問題的試劑。A3:

在條件允許的情況下，在不同的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)建立反應(yīng)，尤其是當(dāng)應(yīng)用質(zhì)粒作為對(duì)照時(shí)(質(zhì)?？梢员缓苋菀讛U(kuò)散并且難以去掉)。A4:

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，避免加樣錯(cuò)誤。反應(yīng)效率E過高或過低效率低于90%

，其原因包括試劑濃度不適(如引物)，Tm以及熱循環(huán)條件不適。因此，試管中各種源物質(zhì)的競爭作用可造成反應(yīng)效率低下。

效率高于110%

說明反應(yīng)過程中存在抑制作用。引起抑制作用的原因包括RNA或DNA質(zhì)量較差，模板濃度過高及含有核酸純化的殘余物(苯酚、乙醇)。

A1:

對(duì)于抑制作用，可去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到110%以下，則分析良好。A4:

通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。A2:

重新純化模板。延長干燥時(shí)間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇。A3:

根據(jù)引物的Tm值，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當(dāng)，且引物設(shè)計(jì)時(shí)使之有相似的Tm值。待測樣本反應(yīng)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的動(dòng)態(tài)范圍之外A1：重新構(gòu)建覆蓋待測樣本模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(改變稀釋倍數(shù))

，分析并確保在新的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的線性。要求：用于作標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板范圍必須涵蓋全部待測樣本模板濃度，使得待測樣本模板的擴(kuò)增結(jié)果在實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。A2：如果待測樣本的Ct值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線上最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，稀釋待測樣本后重做