觸角電位技術(shù)與氣譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)在昆蟲鑒定和利用中的應(yīng)用比較

觸角電位技術(shù)與氣譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)在昆蟲鑒定和利用中的應(yīng)用比較

在它們的生存過程中，昆蟲需要覓食、喂食、交配和繁殖等一系列活動。植物發(fā)射信息物質(zhì)在這些生存活動中發(fā)揮著不可替代的作用。植物揮發(fā)性信息化合物是指植物釋放的含有一定化學信息的次生代謝物質(zhì),其分子量在100~200,主要包括萜、醛、酮、醇類物質(zhì),以及有機酸和含氮硫化合物等。目前,測定昆蟲對某些化合物的反應(yīng)所采取的技術(shù)種類主要包括“Y”型嗅覺儀、風洞技術(shù)、觸角電位儀(EAG)等[15~20]。而測定昆蟲對某些化合物的反應(yīng)最準確的方法是觸角電位儀,后來隨著氣相色譜(GC)的進一步發(fā)展,出現(xiàn)了EAG與GC聯(lián)用的方法。詳細介紹昆蟲觸角電位儀和氣相色譜-觸角電位儀聯(lián)用技術(shù),旨為相關(guān)研究提供幫助。1速檢測嘴唇觸角電位圖(electroantennogram,EAG)是快速檢測觸角對氣味的反應(yīng)活性和敏感性方面非常重要的生物測定方法。由于它具有很高的敏感性和選擇性,被廣泛地應(yīng)用于昆蟲行為學研究中,成為昆蟲信息素及其他揮發(fā)性信息化合物生物測定非常得力的工具之一。1.1化學刺激物eag1957年Schneider等首先利用EAG技術(shù)研究家蠶(Bombyxmori)的嗅覺電生理,并進一步提出EAG技術(shù)記錄的是觸角上所有嗅覺感受器對氣味刺激物的電反應(yīng)的總和,其大小是由雄蟲觸角嗅覺感受細胞去極化(depolarization)反應(yīng)的整合效應(yīng)決定的。EAG電位是許多化學感器被氣體分子激活的一種相對量度。觸角電位反應(yīng)的振幅隨刺激物濃度的增加而增加,直至達到飽和。昆蟲觸角上存在豐富多樣的化學感器,特別是毛形感器和錐形感器,主要感受環(huán)境中的化學氣味。氣味通過感器上的微孔進入感器淋巴液中,與淋巴液內(nèi)的氣味結(jié)合蛋白(Oder-bindingprotein,OBP)相結(jié)合,形成氣味-OBP復合體,復合體再與感受細胞的樹突膜相互作用,產(chǎn)生動作電位。這種電位信號傳入昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起昆蟲的行為反應(yīng)。觸角上分布有很多這樣的感受細胞。當活性氣體化合物刺激觸角時,大量的感受細胞會產(chǎn)生相應(yīng)的電生理反應(yīng),在觸角的兩端可得到一個總的電位變化,用儀器將這種電位變化記錄下來就構(gòu)成了觸角電位圖。1.2昆蟲嘴唇電位EAG主要包括數(shù)據(jù)采集控制器、刺激氣流控制單元、顯微操作臺、昆蟲觸角電位探頭。采集控制器連接一臺電腦,通過EAG的記錄分析程序,獲得和分析試驗數(shù)據(jù)。1.3煙嗪蝶蜂對昆蟲的誘導作用目前,EAG被廣泛應(yīng)用于各種信息物質(zhì)對昆蟲行為調(diào)控機制的研究工作當中。利用EAG可以測定昆蟲對不同物質(zhì)的電生理反應(yīng)。如董文霞等利用EAG技術(shù)測定了煙蚜繭蜂(Aphidiusgifuensis)對蚜蟲性信息素(荊芥醇和荊芥內(nèi)酯)和報警信息素(反-β-法尼烯)以及煙草揮發(fā)性物質(zhì)的電生理反應(yīng)。而將EAG和嗅覺儀結(jié)合分析,可從電生理和行為兩方面證明昆蟲對某種物質(zhì)有誘集或趨避作用。例如郝德君等在松墨天牛對雪松揮發(fā)物的觸角電位和嗅覺反應(yīng)的研究中,利用嗅覺儀和EAG儀比較分析了松墨天牛成蟲對健康雪松枝條揮發(fā)物的嗅覺反應(yīng)和觸角電位反應(yīng),及其對健康木揮發(fā)物的日齡變化規(guī)律。2煤氣表-開口的聯(lián)合技術(shù)2.1gc-ead與氣相色譜質(zhì)譜1957年由于毛細柱色譜的出現(xiàn),使GC的分離效能獲得了極大地提高。隨著毛細柱色譜技術(shù)的成熟,氣相色譜逐漸具備了分辨率高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點。但是氣相色譜的物理檢測器如火焰離子化檢測器(FID)不能檢測被檢物的生物活性,所以在1975年,Arn等發(fā)展了GC與EAG聯(lián)用技術(shù)GC-EAD。這項技術(shù)充分發(fā)揮了氣相色譜選擇性強、靈敏度高等優(yōu)點,同時利用觸角電位儀采集觸角對信息物質(zhì)不同成分的電生理反應(yīng),再通過統(tǒng)計分析,確定在昆蟲行為調(diào)控中發(fā)揮作用的具體成分。同時對樣品進行GC-MS(氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù))檢測,結(jié)合GC-EAD結(jié)果中信息物質(zhì)在氣相色譜中的出峰時間對應(yīng)GC-MS結(jié)果中對應(yīng)時間所檢測的物質(zhì),確定信息物質(zhì)的具體成分。2.2補充載氣和火焰離子化檢測GC-EAD基本原理是:待分析樣品由GC進樣器進樣后,各種成分經(jīng)毛細管色譜柱分離,再經(jīng)分流閥按一定比例分流。在分流閥處加入20~30mL/min的補充載氣,以減少柱后死體積。一部分分流的樣品經(jīng)毛細柱(未涂固定液)到火焰離子化檢測器,另一部分分流的樣品經(jīng)同樣的毛細柱(位于毛細柱傳輸管中,其溫度比爐溫稍高)到L型玻璃管,然后由濕潤的空氣帶到玻璃電極間的昆蟲觸角上,進行樣品的觸角電位測定。在測定結(jié)果的分析過程中,可以忽略那些沒有觸角電位反應(yīng)的成分,快速準確地選擇樣品峰與觸角電位反應(yīng)峰相對應(yīng)的成分進行進一步研究。2.3揮發(fā)性物質(zhì)的化學成分目前,GC-EAD技術(shù)與GC-MS結(jié)合在信息物質(zhì)成分鑒定領(lǐng)域中是最常見的方法。其特點是:檢測時間短,鑒定成分準確,結(jié)果分析方法簡單。陸宴輝對盲蝽蟓生態(tài)適應(yīng)性進行研究,利用GC-EAD測定發(fā)現(xiàn),綠盲蝽雌雄成蟲對棉花、綠豆揮發(fā)物反應(yīng)相似。結(jié)合GC-MS的鑒定分析,綠盲蝽對棉花中1ue00f3-二甲基苯和2ue00f2-丙酸丁酯2種揮發(fā)物反應(yīng)比較強烈。而綠豆中綠盲蝽反應(yīng)比較強烈的揮發(fā)物有苯乙酮、壬醛等。其中,綠盲蝽對苯乙酮的反應(yīng)明顯強于2種植物中其他組分。李建光在光肩星天牛對寄主植物揮發(fā)性物質(zhì)的行為反應(yīng)及作用機理的研究中采用動態(tài)頂空采集、熱脫附及GC-MS技術(shù)等手段相結(jié)合的方法,對光肩星天牛的嗜食樹種(復葉槭)、感蟲樹種(合作楊、小美旱楊、柳樹)、抗蟲樹種(新疆楊、毛白楊、沙棗)和非寄主樹種(白蠟和臭椿)的揮發(fā)性物質(zhì)的化學組成進行了比較研究。利用EAG和GC-EAD技術(shù),測定了光肩星天牛對從寄主樹種提取的揮發(fā)性物質(zhì)的電生理反應(yīng)。GC-EAD技術(shù)的發(fā)展加快了信息物質(zhì)調(diào)控昆蟲行為機制的研究,其與GC-MS技術(shù)的結(jié)合,使人們能夠更快地鑒定各種信息物質(zhì)的具體成分,為信息物質(zhì)的利用和新農(nóng)藥的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。3黑胰腺金龜及gc-ead對葉綠素質(zhì)量檢測的作用EAG的儀器簡單,檢測時間較短,主要應(yīng)用于已知物質(zhì)對于昆蟲的電生理反應(yīng),這樣可以快速準確地得到結(jié)果。GC-EAD連接氣相色譜,每次操作前需啟動氣相色譜,待達到檢測條件后才能開始檢測。另外,GC-EAD在樣品刺激觸角前對樣品進行分離,所以,檢測時間較長。但EAG能確定信息物質(zhì)的具體成分在氣相色譜中的出峰時間,通過與GC-MS結(jié)果結(jié)合,可以確定信息物質(zhì)的具體成分。所以,GC-EAD主要應(yīng)用于未知物質(zhì)中信息物質(zhì)的確定,可以精確鑒定出信息物質(zhì)的具體成分。根據(jù)不同的目的選擇適合的技術(shù)是非常重要的。EAG技術(shù)主要應(yīng)用于單一物質(zhì)不同濃度或不同信息物質(zhì)配比對昆蟲進行調(diào)控的研究中。例如孫凡等在東北大黑鰓金龜對綠葉氣味的觸角電位及行為反應(yīng)中利用EAG技術(shù)和風洞試驗,測試了東北大黑鰓金龜成蟲對2種綠葉氣味———反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇的電生理和行為反應(yīng)。付曉偉等在煙夜蛾和棉鈴蟲對高濃度煙草揮發(fā)物的電生理和行為反應(yīng)試驗中,運用EAG技術(shù)和風洞技術(shù),測定了2種夜蛾的處女雌蛾、交配雌蛾及雄蛾對20種高濃度(0.1mol/L)煙草揮發(fā)物的電生理和行為反應(yīng)。但如果待測物質(zhì)是混合物,利用EAG技術(shù)只能檢測混合物對昆蟲是否有電生理反應(yīng),不能進一步判斷其具體的信息物質(zhì)。GC-EAD技術(shù)主要應(yīng)用于多組分物質(zhì)中信息物質(zhì)的鑒定。利用GC-EAD技術(shù)能夠相對快速準確地鑒定信息物質(zhì)的組成成分。但對于火焰離子檢測器檢測不到的微量成分,容易被忽略。例如赤松毛蟲性信息素成分被鑒定為順5ue00f反7-十二碳二烯醇,但是田間試驗結(jié)果證實,順5ue00f反7-十二碳二烯醇、順5ue00f反7-十二碳二烯乙酸酯和順5ue00f反7-十二碳二烯丙酸酯以一定比例混合后誘蛾量顯著高于順5ue00f反7-十二碳二烯醇。赤松毛蟲性信息素腺體提取物的毛細柱氣相色譜分析結(jié)果表明,除順5ue00f反7-十二碳二烯醇以外,還發(fā)現(xiàn)少量的順5ue00f反7-十二碳二烯乙酸酯和順5ue00f反7-十二碳二烯醛,但未發(fā)現(xiàn)順5ue00f反7-十二碳二烯丙酸酯。以順5ue00f反7-十二碳二烯醇、順5ue00f反7-十二碳二烯乙酸酯、順5ue00f反7-十二碳二烯丙酸酯和順5ue00f反7-十二碳二烯醛4種標準化合物進行GC-EAD分析表明,除順5ue00f反7-十二碳二烯醛外,其它3種標準化合物均有EAD反應(yīng)。因此推斷,赤松毛蟲性信息素