豬疫病診斷技術(shù)圓環(huán)病毒

豬疫病診斷技術(shù)圓環(huán)病毒范圍本文件描述了豬圓環(huán)病毒1型（PorcineCircovirusType1，PCV1）、2型（PorcineCircovirusType1，PCV2）和3型（PorcineCircovirusType3，PCV3；）的熒光PCR檢測(cè)及鑒別檢測(cè)技術(shù)。本文件適用于豬圓環(huán)病毒1型、2型和3型的快速分子診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。試劑或材料水：符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.27?g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.42?g、氯化鈉（NaCl）8?g、氯化鉀（KCl）0.2?g，加滅菌水約800?mL充分?jǐn)嚢枞芙?，加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，定容至1?000?mL。核酸提取試劑：市售病毒DNA/RNA提取試劑盒或磁珠法提取試劑盒。熒光PCR試劑盒。儀器設(shè)備熒光定量PCR儀。震蕩研磨儀。高速冷凍離心機(jī)：離心力≥8?000?g。電子天平：精度0.000?1?g。生物安全柜。冰箱：2?℃～8?℃，-20?℃以下和-70?℃以下。渦旋振蕩器。診斷方法臨床診斷流行特點(diǎn)豬是PCV的天然宿主，各種年齡、不同性別的豬都可以感染，但以哺乳期和育成期的豬最易感。病豬和帶毒豬是主要的傳染源，可經(jīng)口腔、呼吸道、精液感染不同日齡的豬，少數(shù)孕豬還可經(jīng)胎盤垂直傳播。臨床癥狀斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）引起斷奶期進(jìn)行性消瘦、皮膚蒼白、呼吸困難、厭食、精神沉郁、被毛粗亂、出現(xiàn)以咳嗽、噴嚏、呼吸加快及呼吸困難為特征的呼吸障礙，10?%～20?%豬的皮膚和可視粘膜可見(jiàn)黃疸，豬群的死亡率增加，體表淋巴結(jié)，特別是腹股溝淺淋巴結(jié)腫大，有的還表現(xiàn)腹瀉和中樞神經(jīng)癥狀。其它臨床癥狀，包括咳嗽、發(fā)熱、胃炎、腦膜炎及突然死亡。豬腎病與皮炎綜合征（PDNS）斷奶仔豬和育肥豬食欲減退，有時(shí)體溫上升，皮下水腫，皮膚表面出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形隆起，紅色或紫色、中央發(fā)黑的斑塊。破損皮膚常融合成大的塊。通常病變?cè)诤笾?、腹部首先發(fā)現(xiàn)，然后慢慢向胸、耳等部位擴(kuò)展。剖檢，在大部分死亡豬中，可見(jiàn)雙腎腫大、蒼白、皮質(zhì)有出血小點(diǎn)。仔豬的先天性震顫（CT）出生后3周齡仔豬，因痙攣而出現(xiàn)步態(tài)異常姿勢(shì)，從雙耳，被毛和尾巴等發(fā)抖，發(fā)展到全身肌肉有節(jié)奏性扭擺，后肢嚴(yán)重痙攣，呈跳躍運(yùn)動(dòng)等。欲稱“仔豬跳跳病”或“仔豬抖抖病”，是仔豬剛出生不久，出現(xiàn)全身或局部肌肉陣發(fā)性攣縮的一種疾病。另一種表現(xiàn)是后肢肌肉呈強(qiáng)直性痙攣，后肢分開(kāi)，似犬坐姿勢(shì)，尾部輕微震顫，病豬可在3周內(nèi)康復(fù)。豬增生性和壞死性肺炎（PNP）與保育豬和育肥豬發(fā)生的呼吸道病有關(guān)。PNP的確診主要依據(jù)組織病理學(xué)變化，表現(xiàn)為增生性和壞死性肺炎，病豬主要表現(xiàn)呼吸困難，肺臟見(jiàn)點(diǎn)狀出血。病理診斷剖檢病變?yōu)樨i只消瘦，貧血，皮膚蒼白，黃疸，最顯著的剖檢變化是全身淋巴結(jié)腫大，特別是腹股溝淺淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、氣管支氣管淋巴結(jié)及下頜淋巴結(jié)腫大2～5倍，有時(shí)可達(dá)10倍。切面硬度增大，可見(jiàn)均勻的白色，所有病例幾乎都能看到肺萎縮不全，重量和硬度增加，部分病例尖葉有固質(zhì)化、致密的病灶，肺有輕度的多灶性或高度的彌漫性間質(zhì)肺炎。肺臟腫脹，堅(jiān)硬似橡皮樣；肝臟發(fā)暗，肝小葉間結(jié)締組織增生。肝臟最常見(jiàn)到門脈周圍淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞浸潤(rùn)，具有竇狀隙內(nèi)單核炎性細(xì)胞集聚和肝細(xì)胞的單細(xì)胞壞死為特征的肝炎。慢性死亡病例，由于黃疸而使肝小葉周圍纖維化，肝細(xì)胞壞死、消失及單核細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)。腎臟水腫、蒼白，被膜下有壞死灶。顯微鏡觀察，淋巴結(jié)的皮質(zhì)區(qū)及副皮質(zhì)區(qū)顯著擴(kuò)張，有單核和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，有時(shí)散布有大量的多核巨細(xì)胞，有些淋巴細(xì)胞萎縮，少數(shù)情況還有壞死。肝臟表現(xiàn)不同程度的炎癥，有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)也有炎癥存在。實(shí)驗(yàn)室診斷樣品采集細(xì)胞培養(yǎng)樣品按照GB19489規(guī)定，取細(xì)胞培養(yǎng)樣品。剖檢樣品按照NY/T541規(guī)定采集病死豬的淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和肺臟等組織樣品。樣品的保存及運(yùn)輸樣品2?℃～8?℃貯藏。樣品保存在2?℃～8?℃條件下不超過(guò)24?h，-20?℃以不超過(guò)3個(gè)月，-70?℃以下不超過(guò)5年。必須低溫保存運(yùn)輸樣品，且在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達(dá)和檢測(cè)。樣品處理淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和肺臟等組織樣品取適量大小的組織塊放入盛有500?μLPBS（4.2）的研磨管中，6?000?r/min震蕩研磨45?s，制成約10?%的組織勻漿液，5?000?r/min離心5?min，上清液備用。細(xì)胞培養(yǎng)樣品將細(xì)胞培養(yǎng)樣品反復(fù)凍融3次，3?000?r/min離心5?min，棄去細(xì)胞碎片，上清備用。試驗(yàn)步驟核酸提取采用DNA提取試劑盒提取各類樣本中的病毒核酸。如在2?h內(nèi)檢測(cè)可將提取的核酸置于冰上保存，否則應(yīng)置于-20?℃冰箱保存，具體操作步驟如下：取上清液（6.3.3）200?μL置于1.5?mL離心管中，加入500?μL裂解液，在渦旋振蕩器上振蕩30?s混勻，室溫靜置2?min；裂解后的液體移入吸附管柱，6?000?r/min，離心5?min；此時(shí)病毒DNA會(huì)吸附再管柱底部的膜上。加500?μL洗液至管柱上，6?000?r/min，離心5?min，棄去洗液；重復(fù)上一步驟1次；8?000?r/min離心10?min，去除殘留在膜上的乙醇；將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，開(kāi)蓋室溫靜置2?min；加入50?μL洗脫液，室溫靜置1?min；將含有吸附柱的離心管，8?000?r/min離心1.5?min，得到DNA。熒光PCR擴(kuò)增設(shè)25?μL反應(yīng)體系，熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系見(jiàn)表1，熒光PCR擴(kuò)增引物參見(jiàn)附錄A。熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系序號(hào)組分用量12×SYBR?GreenProTaqHSPremix*612.5210?μMPCV-F1.0310?μMPCV1-R1.0410?μMPCV2-R1.0表1熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系（續(xù)）序號(hào)組分用量510?μMPCV3-R1.06模板DNA1.57ddH2O7檢測(cè)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照，熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見(jiàn)表2。熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件序號(hào)進(jìn)程反應(yīng)條件反應(yīng)時(shí)間1預(yù)變性95?℃30?s2變性95?℃30?s3退火62?℃30?s4延伸72?℃10?s5循環(huán)數(shù)（2～4）40—6信號(hào)采集退火時(shí)采集—結(jié)果判定結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測(cè)樣品的熔解曲線峰值溫度，溫度誤差0.1?℃范圍內(nèi)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照參見(jiàn)附錄B。陰性對(duì)照熔解曲線無(wú)峰值。樣品檢測(cè)結(jié)果分析在陽(yáng)性和陰性成立前提下，樣品檢測(cè)結(jié)果判定如下：熔解曲線峰值溫度為84?℃，則樣品中含有PCV1；熔解曲線峰值溫度為85?℃，則樣品中含有PCV2；熔解曲線峰值溫度為82?℃，則樣品中含有PCV3；熔解曲線峰值溫度為84?℃和85?℃，則樣品中含有PCV1和PCV2；熔解曲線峰值溫度為84?℃和82?℃，則樣品中含有PCV1和PCV3；熔解曲線峰值溫度為85?℃和82?℃，則樣品中含有PCV2和PCV3；熔解曲線峰值溫度為84?℃、85?℃、82?℃，則樣品中含有PCV1、PCV2和PCV3。

（規(guī)范性）

熒光PCR擴(kuò)增引物熒光定量PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表A.1。熒光定量PCR擴(kuò)增引物引物名稱序列PCV-F5’-TKGATGATYTTTTATGGSTGG-3’PCV1-R5’-GTCAGCAGTTGAGGACTACCATT-3’PCV2-R5’-AGTAATCCGCCGATAAAGAGC-3’PCV3-R5’-CTCCTAAACAAGGCCTCCAACT-3’簡(jiǎn)并堿基K：G/T；Y：C/T；S：G/C

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