高效液相色譜法同時(shí)測定碧螺春茶中5種成分

高效液相色譜法同時(shí)測定碧螺春茶中5種成分

碧螺春是中國十大名茶之一。位于江蘇省蘇州市太湖洞庭東山和西山。它以其色澤、香氣、口感和口感而聞名，也是國內(nèi)外的著名茶。同其他的綠茶一樣,碧螺春茶中含有咖啡因和大量的茶多酚。茶多酚是綠茶中的主要活性成分,在綠茶中占15%～30%。兒茶素是茶多酚的主要組分,是良好的抗氧化劑,具有生物活性和抗腫瘤、抗誘變、預(yù)防齲齒等諸多藥效,因而茶多酚已作為一類重要的食品添加劑和藥物,越來越受到人們的關(guān)注。茶多酚中以兒茶素類成分含量居多,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)占茶多酚總量的90%左右。兒茶素類化合物主要包括沒食子兒茶素(GC)、表兒茶素(EC)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸(ECG)和表沒食子兒茶素(EGC)等。目前,對(duì)茶葉中兒茶素的研究較多,但對(duì)碧螺春茶葉中主要活性成分,尤其是茶多酚類含量的研究未見報(bào)道。以往研究茶多酚所采用的方法主要有紫外吸收法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法(HPLC)等,從靈敏度、準(zhǔn)確度上看,HPLC是目前測定兒茶素成分的首選方法,但往往存在著樣品前處理繁瑣、流動(dòng)相系統(tǒng)復(fù)雜、預(yù)分離的組分間分離度不高、樣品分析時(shí)間過長等因素,給分析結(jié)果帶來很大的誤差。筆者在總結(jié)前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,以碧螺春茶為樣本,探索出新的樣品提取方法和色譜分離條件,使得樣品中所有兒茶素類化合物均得到良好的分離,且操作更簡便、更準(zhǔn)確,經(jīng)過大量的樣品測試,該方法不僅適用于碧螺春茶,同樣也可以測定其他綠茶、茉莉花茶以及紅茶中兒茶素類成分的含量,為茶葉的等級(jí)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1甲醇、乙腈、甲醇各等級(jí)碧螺春茶由蘇州東山吳儂碧螺春茶廠提供。LC-10A高效液相色譜儀、SPD-2AS紫外檢測器(日本島津),U6K進(jìn)樣閥(Waters),CSF-1A超聲波清洗器(常州市超聲波設(shè)備廠)。甲醇、乙腈為色譜純(美國TEDIA公司生產(chǎn)),冰醋酸為AR級(jí)試劑,水為二次蒸餾水。沒食子兒茶素((-)-gallocatechin,GC,純度為98%,Sigma),表沒食子兒茶素((-)-epigallocatechin,EGC,純度為98%,Sigma),表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocate-chingallate,EGCG,純度為98%,Sigma),表兒茶素沒食子酸((-)-epicate-chingallate,ECG,純度為98%,Sigma)和咖啡因(caffeine,CAF,Sigma)。1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取GC、EGC、EGCG、ECG和CAF對(duì)照品適量,置于10ml容量瓶,加95%乙醇制成分別含0.071mg/mlGC、0.050mg/mlEGC、0.214mg/mlCAF、0.137mg/mlEGCG和0.148mg/mlECG混合對(duì)照品溶液。1.3乙醇提取的工藝路線取茶葉粉碎并過60目篩,精密稱取約0.5g粉末,加80℃熱水100ml,超聲提取30min,過濾,濾渣再分別以60%乙醇80ml、95%乙醇60ml重復(fù)上述步驟提取2次,合并3次提取液,加水定容至250ml量瓶中,搖勻。取上清液過0.45μm微孔濾膜,作為供試品溶液。1.4流動(dòng)相及洗脫流程色譜柱:ShimpakC18(150.00mm×4.6mm,5μm,島津公司);流動(dòng)相:A為乙腈,B為0.2%冰醋酸溶液,梯度洗脫,洗脫程序見表1;流速:1.0ml/min;柱溫:30℃;檢測波長:280nm。2結(jié)果與分析2.1af、ecgg、ecg的保留時(shí)間取供試品溶液10μl進(jìn)樣,記錄色譜圖,GC、EGC、CAF、EGCG和ECG的保留時(shí)間分別為6.37、21.69、24.98、32.46和46.31min,各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5。對(duì)照品及供試品的色譜如圖1、2所示。2.2各成分線性回歸分析分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0μl,進(jìn)樣測定。同一體積的樣品平行分析3次,取其平均值。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo)作圖,得到各成分的線性回歸方程(表2)。由表2可知,當(dāng)混合對(duì)照品進(jìn)樣在2.5～15.0μl時(shí),也即GC、EGC、CAF、EGCG、ECG5種成分的進(jìn)樣量分別在0.1775～1.0650、0.1250～0.7500、0.5350～3.2100、0.3425～2.0550、0.3700～2.2200μg范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好(r=0.9993～0.9999)。2.3h預(yù)后樣分析取新制備的同一批碧螺春茶供試品溶液,分別在室溫下放置0、1、2、4、8h后進(jìn)樣分析。GC、EGC、CAF、EGCG和ECG峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.92%、0.84%、1.28%、1.24%和1.01%,表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。2.4加樣回收率和精密度試驗(yàn)取9份已知含量的碧螺春茶提取液各100μl,分為3組,每組3份。每組樣品中分別精密加入混合對(duì)照品溶液80、100、120μl,按所建立的方法進(jìn)行供試品溶液的制備和測定,計(jì)算GC、EGC、CAF、EGCG和ECG含量,計(jì)算各組分的回收率及精密度。表3結(jié)果表明,所有組分的回收率在98.60%～100.19%,RSD均小于1%,說明該方法準(zhǔn)確可靠。2.5品溶液的進(jìn)樣分析分別取6批不同等級(jí)的洞庭碧螺春茶,按“1.3”下的方法操作,取供試品溶液5μl進(jìn)樣分析,并計(jì)算其中5種成分的含量。由表4可知,等級(jí)越高質(zhì)量越好的碧螺春茶,其含有的GC、EGC、ECG相對(duì)均較高,CAF沒有太大的差別,而EGCG含量隨著采摘時(shí)間滯后,略有上升的趨勢。3討論3.1不同濃度兒茶素類及教學(xué)產(chǎn)物的吸收取5種對(duì)照品混合溶液,用紫外-可見分光光度計(jì)在波長200～400nm內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兒茶素類及咖啡因成分在210和280nm均有較強(qiáng)吸收。但考慮到在210nm測定提取液樣品,重現(xiàn)性較差且雜峰干擾較大,所以選用280nm作為檢測波長。3.2流動(dòng)相的選擇前期的研究工作證明,茶多酚類化合物組成復(fù)雜,各成分間極性相差較大,且測定中干擾成分較多,曾選擇了多種等度洗脫流動(dòng)相,分離效果均不理想,因此選擇了梯度洗脫。流動(dòng)相分別選擇乙腈-水(冰乙酸)、乙腈-水(磷酸)、甲醇-水(冰醋酸)、甲醇-磷酸緩沖鹽、甲醇-乙腈-甲酸等體系進(jìn)行梯度洗脫試驗(yàn),通過比較分離度、出峰時(shí)間、峰寬和峰的對(duì)稱性等因素,最后確定為乙腈-水(冰乙酸)體系最合理。從供試品色譜圖(圖2)中可以看到,該色譜條件不僅可以測定1、3、4、5、9號(hào)峰對(duì)應(yīng)GC、EGC、CAF、EGCG、ECG類成分,對(duì)2號(hào)峰C、6號(hào)峰EC和8號(hào)峰GCG同樣可以測定,但由于這些成分在樣品中含量較低,在此未作研究。3.3柱溫的確定在試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),使用表1的梯度洗脫程序,柱溫對(duì)各組分的分離有一定影響,分別采用在20、30、40℃條件下,對(duì)碧螺春茶葉供試品溶液進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)20℃時(shí),EGC峰和CAF峰以及EGCG峰和EC峰分離較差,整個(gè)色譜圖出峰時(shí)間拖后,分離時(shí)間大約80min,當(dāng)溫度提至40℃時(shí),色譜分離時(shí)間雖然縮短,柱效得到了明顯提高,但溫度過高可能會(huì)影響色譜柱的使用壽命,兼顧上述兩原因,綜合考慮,最后確定柱溫為30℃。3.4樣品前提取方法篩選曾以水、甲醇、乙醇3種溶劑為溶媒對(duì)茶葉進(jìn)行提取試驗(yàn),考慮到溫度高于80℃,有部分的茶多酚類化合物發(fā)生氧化,因此試驗(yàn)條件均采用在80℃進(jìn)行,采用回流、超聲提取和80℃浸泡3種方法對(duì)茶葉的提取效果進(jìn)行比較。液相檢測結(jié)果表明,幾種方法在峰數(shù)目及峰面積上差異很大,熱水提取法,咖啡因和極性大的兒茶素類化合物提取率較高,而有部分的脂溶性兒茶素不能完全溶出;甲醇提取法,雖然提取完全,但提取液中出現(xiàn)大量的葉綠素,進(jìn)行液相色譜檢測時(shí),泵壓明顯增大,對(duì)色譜柱污染嚴(yán)重,使柱壽命變短;乙醇提取法,兼顧了上述兩溶劑