egcg對嗜水氣單胞菌的抑菌機制研究

egcg對嗜水氣單胞菌的抑菌機制研究

嗜水真菌屬于嗜熱菌科和氣單胞菌科。它是一個嗜熱、動態(tài)的氣單胞菌群，通常存在于淡水、廢水、土壤和人類糞便中。具有廣泛的致病性,對水產(chǎn)動物、畜禽和人類均有致病性,在水產(chǎn)上,是魚類最常見的致病菌,對淡水魚感染稱為細菌性敗血癥,此病的發(fā)病率達到90%以上,死亡率高達65%以上,往往給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成慘重的經(jīng)濟損失。目前,由嗜水氣單胞菌引起的水產(chǎn)動物的疾病防治多采用抗生素,但是,抗生素的濫用造成耐藥性的增強,不僅給魚病的治療帶來困難,對人體也造成巨大的危害。而植物提取物以其天然性、無殘留、毒副作用小、不產(chǎn)生耐藥性、價格低廉等優(yōu)點倍受矚目。目前,植物提取物作為免疫增強劑和治療藥物在水產(chǎn)上的應用逐漸增多,起到預防和治療的效果。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocathechingallate,EGCG)是茶多酚中含量最高、生物活性最強的有效成分,對各種細菌、病毒、真菌及植物病原體表現(xiàn)出較高的抗菌活性,另外,具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提高免疫力和抗炎等多種生理功效。因此,EGCG作為一種天然產(chǎn)物抗菌劑,研究其抑菌機理非常必要。目前雖然有關于EGCG抑菌機理的文獻報道,但詳細的作用機制尚未完全清楚。特別是對嗜水氣單胞菌抑菌活性及其機制尚未見文獻報道。因此本文采用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG),以嗜水氣單胞菌為研究對象,進行抑菌活性與機制的研究,為深入認識EGCG的抑菌機理提供參考。1材料和方法1.1儀器和試劑供試菌株嗜水氣單胞菌IB101、JG101、4LNS301、CCH201、LNB101、CG101由中國水產(chǎn)科學院淡水漁業(yè)研究中心惠贈,BSK-10、TPS-30由浙江省淡水水產(chǎn)研究所提供;EGCG遵義陸圣康源科技開發(fā)有限公司;碘化丙丁(PI)南京凱基生物有限公司;紅霉素Sigma。TGL-16C臺式離心機上海安亭科學儀器廠;SW-CJ-2F超凈工作臺蘇州凈化設備廠;電子天平SartoriusCo,Germany;HYG-IIa搖床培養(yǎng)箱上海欣蕊自動化設備有限公司;UV-2100分光光度儀上海龍尼柯儀器有限公司;DDS-11C電導率儀上海精密科學儀器有限公司;FACSCalibur流式細胞儀美國BO公司;H-7000透射電鏡日本HITACHI公司;PW-30精密培養(yǎng)箱。1.2實驗方法1.2.1模式1:c+mec用二倍稀釋法測定EGCG的最低抑菌濃度(MinimumInhibitoryConcentration,MIC)。采用二倍稀釋法對藥液進行梯度稀釋,最后一管不加提取物作空白對照,然后加入菌懸液,37℃培養(yǎng)30h,625nm測定吸光值,無菌生長的試管中的藥物濃度即為該藥物的最小抑菌濃度(MIC),每組重復三次。1.2.2生長曲線測定將嗜水氣單胞菌BSK-10于37℃培養(yǎng)18h,調(diào)整細菌的終濃度大約為106cfu/mL,將MIC濃度的EGCG溶液加入到菌懸液中,37℃下150r/min搖床培養(yǎng),用蒸餾水代替EGCG溶液作為對照組,每隔1h取樣測OD630nm,作出EGCG作用于嗜水氣單胞菌的生長曲線。實驗重復三次,數(shù)據(jù)取其平均值。1.2.3ecgg回復突變試驗將嗜水氣單胞菌BSK-10于37℃培養(yǎng)18h,調(diào)整細菌的終濃度大約為106cfu/mL,分別將1倍、2倍和4倍MIC濃度的EGCG加入菌懸液,對照組不加藥,置于37℃培養(yǎng)箱中,分別于0、2、4、6、8、10h從各管中取出定量培養(yǎng)液,經(jīng)10倍系列稀釋后,轉(zhuǎn)種于相應瓊脂培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)24h后,作菌落計數(shù)。以菌落數(shù)對數(shù)為縱坐標,以孵育時間為橫坐標,在直角坐標系中作圖,即為抗菌藥物濃度變化對細菌的殺菌曲線。1.2.4嗜氧體協(xié)同生長抑制實驗為了檢測抗菌肽是否能增加G-菌細胞外膜的滲透性,我們選用了疏水性的抗生素紅霉素與EGCG進行了對嗜水氣單胞菌BSK-10的協(xié)同生長抑制實驗。吸取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的嗜水氣單胞菌待測菌液2mL加入離心管中。每管中分別加入10μL的EGCG(50μg/mL),再分別加入MIC(16μg/mL)的紅霉素,以加入無菌水作為陰性對照。37℃下孵育不同的時間,用分光光度儀在630nm下檢測吸光值。實驗重復三次,數(shù)據(jù)取其平均值。1.2.5電導率的測量1.2.6細菌細胞的提取取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的待測菌液,加入2倍MIC濃度的EGCG溶液,37℃、150r/min培養(yǎng)孵育4h,以蒸餾水代替EGCG溶液作為對照組。離心待測樣品,菌體沉淀用無菌超純水洗滌3次后分別進行以下操作:處理后的細菌細胞用2.5%的戊二醛/緩沖液固定1h,然后再用1%的鋨酸/緩沖液固定2h,用1%的乙酸雙氧鈾染色,乙醇梯度脫水,環(huán)氧樹脂包埋。緩沖液為0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.4)。制備的樣本用鉆石刀在超薄切片機上切片,用2%的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。通過透射電子顯微鏡觀察抗菌肽對細菌胞膜的影響。1.2.7樣品處理與細胞儀檢測取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的待測菌液,加入2倍MIC濃度的EGCG溶液,加蒸餾水作陰性對照。37℃、150r/min培養(yǎng)孵育3h。離心洗滌樣品,菌體用生理鹽水懸浮,調(diào)整濃度為106cfu/mL。加入碘化丙啶(PI)染液至終濃度為50μg/mL,37℃避光孵育30min后離心,生理鹽水洗去多余的PI并用500μL生理鹽水重懸,上流式細胞儀檢測PI著染陽性細菌數(shù)。實驗重復三次,數(shù)據(jù)取其平均值。2結(jié)果與討論2.1ecgg的抑菌活性EGCG對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出較高的抑菌活性,并且對革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌敏感。本實驗通過最小抑菌濃度的測定來評價EGCG對嗜水氣單胞菌的抑菌活性。從表1可以看出,EGCG對嗜水氣單胞菌的抑制作用較明顯,最小抑菌濃度為25~50μg/mL。2.2egg對細菌生長的影響EGCG對嗜水氣單胞菌生長曲線的影響見圖1,結(jié)果顯示當EGCG加入細菌菌懸液后,無論是高濃度(200μg/mL)還是低濃度(50μg/mL),OD值均呈水平趨勢。說明EGCG即使在低濃度下也完全抑制了細菌的生長。而對照組細菌卻持續(xù)增長,完成了生長的對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。2.3ecgg對殺菌效果的影響EGCG對嗜水氣單胞菌的殺菌曲線見圖2。結(jié)果表明,EGCG的殺菌效果均隨EGCG濃度的增加而呈持續(xù)加強現(xiàn)象。EGCG在2MIC和4MIC濃度時,可以在10h內(nèi)完全殺滅嗜水氣單胞菌。2.4ecgg與激素的協(xié)同作用EGCG滲透G-菌的細胞外膜的能力,通過與疏水性的抗生素紅霉素的協(xié)同抑菌作用來檢測。G-菌與G+菌的區(qū)別在于G-擁有肽聚糖組成的細菌外膜,為細菌提供一個疏水性的表面,外膜對大分子物質(zhì)和疏水性化合物則是透過的屏障。所以,疏水性抗菌劑紅霉素不能有效地穿透細胞壁膜完整的G-菌的外膜,但能穿過某些外膜受損的菌株。因此,這個抗生素被選來作為檢測EGCG誘導的外膜滲透性增加的探針。從圖3中可看到,這個疏水性抗生素和EGCG之間的有效協(xié)同作用是很明顯的。結(jié)果顯示,MIC的EGCG與紅霉素結(jié)合能有效抑制嗜水氣單胞菌的生長,抑菌效果優(yōu)于EGCG和紅霉素單獨使用。本研究結(jié)果顯示,EGCG能增加嗜水氣單胞菌的外膜滲透性。2.5大量外瀉,電導率測定當微生物處于不利環(huán)境或受到藥物毒害時,往往會導致其生物膜流動性降低和半透性喪失,導致細胞內(nèi)離子大量外瀉,電導率升高。由圖4可知,隨著EGCG對菌體作用時間的延長,培養(yǎng)液中相對電導率逐漸增加,4倍MIC濃度的處理組的電導率比MIC濃度組要大。表明菌體經(jīng)EGCG處理后,膜滲透改變,電解質(zhì)的滲出量隨著時間逐漸增大,可能造成細胞膜流動性降低,細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性被破壞,從而起到抑菌作用。2.6嗜鋼單胞菌的形態(tài)分析為了進一步闡明EGCG的殺菌機理,嗜水氣單胞菌與EGCG孵育進行透射電鏡分析,觀察EGCG對細胞超微結(jié)構的影響。由圖5透射電鏡觀測可知,未經(jīng)EGCG處理的對照組嗜水氣單胞菌呈清晰的桿狀結(jié)構,菌體細胞壁和細胞膜連續(xù)完整、表面平滑,細胞結(jié)構完整,沒有損傷(圖5A);EGCG處理4h后,細胞質(zhì)膜破裂,細胞內(nèi)容物外泄,胞質(zhì)成碎渣樣或呈彌散狀(圖5B、C)。根據(jù)這些電鏡圖片,我們可以推斷,EGCG能導致嗜水氣單胞菌細胞壁破裂,內(nèi)容物外泄,最終導致細胞死亡。2.7ecgg對pi染色細胞數(shù)的影響為了進一步揭示EGCG對于嗜水氣單胞菌的損傷情況,我們選用PI細胞活性染色試劑對細菌進行檢測。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料,正常情況下不能進入具有完整細胞膜的活細胞,只有細菌死亡或凋亡,生物膜的完整性被破壞后,PI才能滲入細胞的雙鏈核苷酸中,在488nm的激發(fā)光激發(fā)下,在波長660nm左右檢測到熒光,當細胞通透性增強時,進入細胞內(nèi)的PI增多,熒光強度就增強,根據(jù)發(fā)出熒光的強度判斷其細胞膜受損傷的程度,從而間接反映細胞的狀態(tài)。FACS分析結(jié)果如圖6所示,與對照組比較,隨著細菌與EGCG孵育時間的延長,PI染色細胞逐漸增多,熒光強度增強,表明細胞膜不完整,通透性增強。EGCG未處理前PI染色率為0%(圖A),2MIC的EGCG處理3h后PI染色細胞數(shù)增加到29.25%(圖B)。結(jié)果表明EGCG是以細胞膜為作用靶點之一,能夠破壞細胞膜的完整性,原生質(zhì)外泄,致使細胞死亡,與電鏡結(jié)果一致。3離子溢出試驗EGCG對嗜水氣單胞菌的抑制作用較明顯,最小抑菌濃度為25~50μg/mL。EGCG的抑菌機制通過作用細胞外膜,使其通透性改變,先導致小