聚酰胺樹脂在分離純化黃酮類化合物中的應用

聚酰胺樹脂在分離純化黃酮類化合物中的應用

聚吡咯（pa，俗稱尼龍國）是美國杜普特公司首次開發(fā)的纖維樹脂，于1939年完成工業(yè)化。它是由一系列的酰胺基團聚合而成的一類高分子化合物,按其性質(zhì)可分為兩大類:非反應性或中性聚酰胺及反應性聚酰胺。層析分離中常用的聚酰胺是由己內(nèi)酰胺聚合而成的尼龍6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龍66。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有機溶劑,對堿較穩(wěn)定,對酸尤其是無機酸穩(wěn)定性較差,可溶于濃鹽酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺是一類結(jié)構中含有重復單位酰胺鍵(-CO-NH-)的高分子聚合物,酰胺基團上的O、N原子在酸性介質(zhì)中結(jié)合質(zhì)子而帶正電荷,以靜電引力形成吸附溶液中的陰離子,故可與酚類、酸類、醌類、黃酮類等富含酚羥基的化合物形成氫鍵而被吸附,而與不能形成氫鍵的化合物分離。國內(nèi)外對聚酰胺的研究已經(jīng)非常深入,而且其應用范圍及其廣泛,僅在層析分離的應用就包括黃酮類、多酚類、醌類、酸類、鈀、汞等金屬的分離提取;甚至改性的聚酰胺可以分離蛋白質(zhì),寡聚酰胺可以作為探針用作DNA的電化學傳感器。本文重點介紹聚酰胺在分離純化黃酮類物質(zhì)的應用及研究現(xiàn)狀。1聚吡咯樹脂層析成像研究1.1聚酰胺水劑的氫鍵締合機理聚酰胺樹脂對黃酮類化合物的吸附機理為“氫鍵吸附”學說。由于聚酰胺中含有豐富的聚酰胺基團,酰胺基團上的O、N原子具有很強的電負性,在酸性條件下就極易與質(zhì)子結(jié)合形成帶正電荷的基團;對于黃酮類和多酚類化合物,因為其富含酚羥基,在溶液中可以形成帶負電的陰離子,所以帶負電的酚羥基可以與帶正電荷的酰胺基團通過靜電吸引力形成氫鍵締合產(chǎn)生吸附。這種氫鍵吸附強度主要取決于化合物中羥基的數(shù)目與位置、以及溶劑與化合物或溶劑與聚酰胺之間形成氫鍵的締合能力大小,有一定的規(guī)律性:(1)形成氫鍵的基團數(shù)目越多,則吸附能力越強,分子中芳香化程度越高,則吸附性越強;(2)溶劑與化合物易形成分子內(nèi)氫鍵者在聚酰胺上的吸附相應減弱;(3)聚酰胺與物質(zhì)的氫鍵締合能力在水中最強,在含水醇中則隨著醇濃度的增高而相應減弱,在高濃度醇或其它有機溶劑中則幾乎不締合;(4)強酸或強堿均可破壞聚酰胺與溶質(zhì)之間的氫鍵締合。聚酰胺的這些性質(zhì)就決定了它在黃酮類化合物分離純化中起到的作用。1.2分離機理1.2.1“氫限制”理論1.2.2“雙層析”理論1.3酰胺類化合物由于聚酰胺分子中含有大量酰胺基團和很長的脂肪鏈,而酰胺基團是極性基團,脂肪鏈是非極性的,這就決定了聚酰胺是一個極性相對較弱的高分子化合物。當用極性較強的溶劑作為洗脫液(如水、乙醇等)時,此時聚酰胺就作為非極性固定相,其層析行為類似反相分配層析(流動相為極性溶劑,固定相為非極性的層析),則首先被洗脫下來的是極性較大的化合物,隨著洗脫劑溶劑極性的逐漸降低,化合物按照極性從大到小的順序可相繼被洗脫下來。2聚酰胺的分離和富集總黃酮的工藝研究在自然界中,黃酮類化合物廣泛存在于多種植物和其他中藥材原料中,例如回心草、甜茶、金蓮花、益母草、銀杏葉、山楂、甘蔗、板栗花、蜂蜜等里面都含有黃酮類化合物,而且在一些植物中其含量非常高,如在甜茶中黃酮含量高達9.0%~14.60%。黃酮類化合物的研究已經(jīng)非常廣泛而深入,其藥理作用和活性研究也相當深入。有文獻表明,黃酮類化合物有抗炎鎮(zhèn)痛、抗過敏、擴張血管、抗氧化、抗心律失常、改善微循環(huán)、抗脂肪肝、防止動脈硬化、抗病毒、降血脂、減少糖尿病并發(fā)癥、協(xié)同增進抗腫瘤藥物療效等藥理作用。黃酮類化合物的精制純化一般采用樹脂法,不僅方法簡單、成本低、效率高、穩(wěn)定性好和容易再生等特點,而且其安全性也高,沒有重金屬和有毒有機試劑殘留等問題。聚酰胺在層析應用中會遇到一些問題,如濾水性差、單位質(zhì)量吸附量小、有小分子夾帶的問題。王怡紅等人聚酰胺柱進行了改進,即將聚酰胺涂裝在硅藻土上,制成的改性聚酰胺柱,從而改善了濾水性,相應提高了單位質(zhì)量聚酰胺的吸附量,消除了小分子夾帶問題。同時可以預先篩去聚酰胺細粉或與硅藻土(1:2)混合物裝柱,以及加壓沖洗等方法克服沖洗速率慢的問題。當用含有甲醇的溶劑進行洗脫時,往往所得到的黃酮類化合物中含有低分子量的聚酰胺,可采用50%甲醇水溶液預先洗滌除去。山西醫(yī)科大學藥學院的白云娥、漆小梅等人,確定了用聚酰胺從金蓮花中分離富集總黃酮的最佳工藝。首先比較30~60目、60~80目、100~200目這3種型號聚酰胺的靜態(tài)吸附量和解吸率,確定了60~80目的聚酰胺對金蓮花總黃酮的吸附量最大,解吸率最高;然后分別考察了上樣藥液pH值、上樣濃度、最大吸附容量、洗脫溶劑的選擇等因素對分離富集總黃酮的影響,確定了最佳工藝條件為上樣藥液pH值為3,上樣濃度為1︰3(g·mL-1),最大吸附容量為0.2833g·mL-1(每1mL聚酰胺最大吸附0.2833g生藥),洗脫溶劑為水和50%的乙醇。哈爾濱醫(yī)科大學藥學院的甘春麗,王晶等采用薄層聚酰胺和聚酰胺柱色譜作為分離手段,結(jié)合紫外、紅外吸收光譜進行檢測,從而達到從藤茶中分離得到黃酮醇與二氫黃酮醇類化合物的目的。藤茶水煮液低溫過夜的結(jié)晶過聚酰胺柱,用乙醇梯度洗脫,20%~30%乙醇洗脫部分用聚酰胺薄層板色譜(展開劑:氯仿-甲醇-甲酸=50︰48︰2)結(jié)合紫外、紅外吸收光譜圖檢測為二氫楊梅素;而40%~50%檢測為楊梅素。楊梅素與二氫楊梅素的酚羥基數(shù)目相同,區(qū)別僅在2,3位飽和度不同,它們在聚酰胺上的色譜行為差別較小。如果采用聚酰胺柱色譜用填料進行分離時,很難得到純品;而選用聚酰胺薄層填料進行柱色譜,由于其粒度較小,因此柱效較高,可得到純品。但由于填料粒度較小,流速會減慢,故需要加壓來加快流速。張蕾,廖瓊峰等人采用聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用的方法富集苦參中的總黃酮?？鄥悠啡芤河镁埘０肺?先用水洗脫除去雜質(zhì),將除雜后的聚酰胺加于AB-8大孔吸附樹脂頂部,用80%的乙醇溶液洗脫,這種方法能夠有效地富集總黃酮,且可與其生物堿類成分有效分離?？疾斓玫降淖罴压に嚄l件為浸膏與聚酰胺比為1∶1,與樹脂比為1∶3,用80%乙醇洗脫,收集洗脫液3BV,最終富集總黃酮的質(zhì)量分數(shù)可達(53.6±2.2)%,收率為(72.1±3.7)%。這種聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用的方法比目前常用的黃酮富集方法效果要好,而且工藝比較簡單,具有良好的應用前景。閻欲曉,黃玥用超聲波輔助提取甘蔗葉中總黃酮,并對超聲提取的工藝進行考察,得出乙醇濃度80%,提取溫度60℃,超聲提取時間60min,料液比1∶40,超聲波功率為104W時為最佳提取工藝。然后采用聚酰胺樹脂對甘蔗葉黃酮粗提物進行分離純化。并研究甘蔗葉黃酮對羥自由基(·OH)、超氧自由基(O2-·)和亞硝酸(NO2-)的清除能力。甘蔗葉黃酮清除羥自由基的IC50為0.038mg·mL-1,清除超氧陰離子的IC50為0.092mg·mL-1,清除亞硝酸根的IC50為0.12mg·mL-1。朱茂田,馬力利用超臨界CO2流體從干姜中萃取出姜精油,然后用正己烷對其萃取,分液后上柱層析。吸附樹脂采用聚酰胺樹脂為填充物的柱層析法,不但吸附量大而且純化效果好。最后得到生姜黃酮純度為72.3%。李厚全,陳磊等探討了聚酰胺對白背三七的純化條件及效果。采用紫外分光光度法測定總黃酮含量,以總黃酮的保留率和轉(zhuǎn)移率為指標,考察上樣液和清洗液pH為3.0、上柱吸附流速為2BV/h、樹脂藥材比為2︰1、樹脂徑高比為1︰8、70%乙醇為洗脫液、清洗流速為5BV/h、洗脫流速為4BV/h為最佳純化條件。在這些所篩選的純化條件下,總黃酮的含量由粗體物的2.43%提高到了24.6%。此純化條件使白背三七總黃酮含量提高了10倍以上,為了進一步研究作為參考依據(jù)。3聚合物載體的篩選聚酰胺在其他領域也有廣泛的應用。例如用冰醋酸制備改性的聚酰胺,改性聚酰胺可對蛋白質(zhì)進行吸附分離。樹枝狀聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)是一種三維的、高度枝化的樹枝狀高分子,具有單一分散性、無免疫原性、細胞毒性較低、生物可降解等特性目前作為藥物載體在藥學領域引起了高度關注。聚酰胺-胺樹形分子在處理造紙污水上面也有重要的應用。4聚酰胺層析分離機理聚酰胺樹脂的應用范圍十分廣泛,其使用壽命長,再生利用效果好分離,操作簡單,成本低,分離效果好等諸多的優(yōu)點就決定的聚酰胺會得到更多的重視和青睞,且其在層析分離上的應用也會更加受到關注。聚酰胺的層析作用機理目前還沒有一個比較系統(tǒng)科學的研究,相信隨著聚酰胺受到的關注增多,會有越來越多的人從事這個機理研究工作,這也將會有一個更大的突破。聚酰胺分離機理的第一種學說是“氫鍵吸附”學說。當溶劑分子與聚酰胺或黃酮類化合物形成氫鍵締合的能力越強,則聚酰胺對這兩種化合物的吸附作用將越弱。聚酰胺層析柱就是利用這種性質(zhì)對黃酮類化合物進行吸附、洗脫而分離的。Stahl等人結(jié)合前人的工作,采用兩種不同極性溶劑系統(tǒng)來比較某些黃酮苷與黃酮苷元在聚酰胺柱上的層析行為。結(jié)果是:當采用極性較小的溶劑系統(tǒng)(苯∶丁酮∶甲醇=60∶20︰20)洗脫時,發(fā)現(xiàn)黃酮苷元比黃酮苷先被洗脫下來;而當采用極性較大的溶劑系統(tǒng)(水∶乙醇∶丁酮∶乙酰丙酮=65∶15︰15︰5)洗脫時,物質(zhì)被洗脫出來順序剛好與上面的相反。這種現(xiàn)象用“氫鍵吸附”學說無法解釋。所以這時候有人提出了聚酰胺層析分離的第