植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的常見問題

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的常見問題

植物組織培養(yǎng)起源于haberlandt（1902）的工作，已有100多年的歷史。廣義的組織培養(yǎng)不僅包括在無(wú)菌條件下利用人工培養(yǎng)基對(duì)植物組織的培養(yǎng),而且包括對(duì)原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞和植物器官的培養(yǎng)。現(xiàn)在植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在科研和生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用,成為最常用的生物技術(shù)之一。雖然植物組織培養(yǎng)的操作過程并不復(fù)雜,但在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過程中常常會(huì)遇到一些問題,重者會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的失敗,給科研和生產(chǎn)造成損失。針對(duì)植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的幾個(gè)問題進(jìn)行分析,并提出實(shí)驗(yàn)改進(jìn)方法。1培養(yǎng)基母溶液的制備MS培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基,下面以MS培養(yǎng)基為例,簡(jiǎn)述其母液配制過程常出現(xiàn)的問題及改進(jìn)方法。1.1hp2-ro1最佳沉淀液的配制大量元素中的Ca2+與SO42-和HPO42-容易生成CaSO4、CaHPO2沉淀。改進(jìn)方法是把其中的Ca2+單獨(dú)配制成一個(gè)貯備液,而把其它的大量元素配制成另一個(gè)貯備液?？紤]到大量元素的溶解及使用方便,通常配制成20倍母液。例如配制1000mL培養(yǎng)基,只需取50mL大量元素母液。1.2制備納米母溶液1.2.1抗菌材料的溶解在配制微量元素母液時(shí)常常出現(xiàn)加人鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)后,鉬酸鈉難溶解,即使通過加熱也無(wú)法解決。較好的方法是先用室溫下的蒸餾水單獨(dú)溶解后再倒人微量元素母液內(nèi)。1.2.2母液的配制微量元素的用量極微。特別是其中的硫酸銅(CuSO4·2H2O)和氯化鈷(CoCl2·6H2O)按配制100倍母液計(jì)算,配制1000mL的母液僅需分別稱取5mg。若沒有分析天平或分析天平的稱量誤差較大很難準(zhǔn)確稱取,解決的方法是分別稱取50mg溶解于少量的水,再加水定容至100mL后,用移液管準(zhǔn)確吸10mL。1.2.3鐵鹽的結(jié)晶MS配方中的鐵鹽是EDTA螯合鐵,它是由硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)與乙二胺四乙酸鈉(Na2-EDTA·2H2O)螯合而成。新配制的螯合鐵顏色為淡黃色,貯存一段時(shí)間顏色會(huì)加深但無(wú)結(jié)晶析出,不影響它的質(zhì)量。如果剛配制的鐵鹽放入冰箱后出現(xiàn)結(jié)晶,可能的原因有:配制螯合鐵時(shí),沒有使FeSO4與Na2-EDTA完全螯合,此時(shí)如果將其放人冰箱保存,由于溫度降低,FeSO4和Na2-EDTA就會(huì)結(jié)晶析出。配制EDTA螯合鐵的改進(jìn)方法:將FeSO2和Na2-EDTA按1000mL母液的用量準(zhǔn)確稱取后分別置于盛有500mL蒸餾水的燒杯中,加熱并不斷攪拌使之溶解,然后一邊加熱一邊把FeSO4溶液慢慢倒入Na2-EDTA溶液中并不斷攪拌直至溶液接近沸騰,停止加熱,待溶液冷卻后倒入試劑瓶,放入冰箱保存。2高壓滅菌鍋內(nèi)空氣手提式、臥式高壓蒸氣滅菌鍋是組培工作中最常用的滅菌裝置。水蒸氣的溫度隨其所受壓力的增加而升高,因而滅菌用的高溫蒸氣都是通過加壓獲得,而空氣的熱脹系數(shù)比水蒸氣大,如果滅菌鍋內(nèi)的空氣沒排除或排除不完全,那么,即使滅菌鍋的壓力表反映出鍋內(nèi)的壓強(qiáng)單位,有空氣存在下滅菌鍋內(nèi)也無(wú)法達(dá)到滅菌所需的溫度。有實(shí)驗(yàn)顯示若鍋內(nèi)的空氣只排除一半,壓力表指針達(dá)到0.105MPa時(shí)。鍋內(nèi)的實(shí)際溫度僅能達(dá)到112℃,比要求的121℃低9℃,導(dǎo)致滅菌不徹底,可能造成培養(yǎng)基的大量污染。所以,高壓滅菌鍋的使用中,關(guān)鍵是設(shè)法排除鍋內(nèi)空氣。常用的排除滅菌鍋內(nèi)空氣的方法是,先關(guān)放氣閥,待鍋內(nèi)壓強(qiáng)升到0.05MPa時(shí),打開放氣閥排出空氣,當(dāng)排放至壓力表指針為零時(shí)再關(guān)閉,繼續(xù)加溫直到鍋內(nèi)壓強(qiáng)達(dá)到滅菌規(guī)定時(shí)開始計(jì)時(shí),按不同滅菌材料,維持一定時(shí)間。組培培養(yǎng)基的滅菌要求是在0.105MPa、維持15~20min。按照這種要求給培養(yǎng)基滅菌時(shí),常發(fā)生有個(gè)別培養(yǎng)基滅菌不徹底。原因可能在于一次排空氣法仍無(wú)法排除鍋內(nèi)的空氣。采用二次排氣法對(duì)培養(yǎng)基滅菌。經(jīng)過多年的實(shí)踐證明,未發(fā)生過培養(yǎng)基滅菌不徹底的現(xiàn)象。高壓蒸氣滅菌鍋二次排氣滅菌法的做法是:先按常規(guī)第一次排氣后,繼續(xù)加熱,當(dāng)壓力表再一次升到0.05MPa時(shí),再排一次鍋內(nèi)的空氣,之后的操作與常規(guī)法相同。3關(guān)鍵技術(shù)的應(yīng)用無(wú)菌操作技術(shù)直接關(guān)系到組培材料及培養(yǎng)基的雜菌污染率,是組織培養(yǎng)過程的關(guān)鍵技術(shù)之一。若無(wú)菌操作技術(shù)不規(guī)范或操作技術(shù)不熟練都可能引起剛接種的外植體或組織苗大面積污染,為減少組織苗的污染率,對(duì)無(wú)菌操作過程的某些環(huán)節(jié)作了改進(jìn),既提高了工作效率,又減少了污染率。3.1每次接種時(shí)只有一個(gè)無(wú)菌的鋁盤3.1.1酒精研磨后再加入酒精燈上燒組織培養(yǎng)中外植體、愈傷組織、叢生芽及出根苗的分切皆要使用培養(yǎng)皿,一般的做法使用一個(gè)小培養(yǎng)皿,接種每一瓶組織苗之前用70%~75%的酒精擦拭后再放到酒精燈上灼燒,這種做法容易產(chǎn)生下面兩種情況。(1)滅菌不徹底,容易形成交叉污染,即某一瓶組織苗污染后通過未經(jīng)完全滅菌的培養(yǎng)皿傳染給其它原來沒雜菌的組織苗,嚴(yán)重者會(huì)引起同時(shí)間內(nèi)接種的材料大部分污染。(2)剛在酒精燈上灼燒的培養(yǎng)皿不容易冷卻,經(jīng)常燙傷叢生芽或出根苗。而且每次都重復(fù)滅菌過程浪費(fèi)大量的時(shí)間,導(dǎo)致接種工作效率低下。3.1.2培養(yǎng)液的滅菌購(gòu)買足量的培養(yǎng)皿(直徑12~16cm),具體數(shù)量可根據(jù)接種人員一個(gè)工作單元所使用的最大量計(jì)算。把培養(yǎng)皿洗凈干燥后用報(bào)紙按每10~20個(gè)為一單位包起來,放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi),在0.144MPa的蒸氣壓下滅菌40min。經(jīng)高溫滅菌后的培養(yǎng)皿是無(wú)菌的。每次使用時(shí)只要取一個(gè)直接使用就可以了,每一瓶組織苗只使用一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿,采用這種方法接種,工作效率提高了,收到明顯的效果。3.2子和手術(shù)刀夾取無(wú)菌操作時(shí),手術(shù)刀和鑷子是最常用的接種工具,可使用手術(shù)刀切開組織塊,用鑷子夾取實(shí)驗(yàn)材料。通常的做法是使用一套鑷子和手術(shù)刀,每次灼燒滅菌后皆要等待冷卻后方可使用。既浪費(fèi)時(shí)間,又容易因趕時(shí)間導(dǎo)致灼燒滅菌不徹底。采用2套用具后,一套在使用時(shí),另一套可放在超凈工作臺(tái)的一邊灼燒和冷卻,工作效率可提高接近1倍。4平液體培養(yǎng)與組織培養(yǎng)的應(yīng)用4.1瓊膠洋菜通常植物組織培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)。在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑,它最主要的作用是使液體培養(yǎng)基凝固,有一些報(bào)道提到采用濾紙、玻璃球、玻璃棉、石英砂、硅石、明膠、硅膠、丙烯酰胺、泡沫塑料,甚至南瓜、馬鈴薯等取代。然而直至目前為止,比瓊脂更方便和更好的支持物仍未發(fā)現(xiàn)。瓊脂又名瓊膠、洋菜或凍粉,它是從海生紅藻(主要是石花菜)中提取的凍膠狀物質(zhì),在96℃時(shí)融化,當(dāng)溫度降至45℃時(shí),又恢復(fù)凝膠狀。瓊脂的主要成分半乳糖,還有少量葡萄糖醛酸,組織苗無(wú)法分解吸收這些物質(zhì)。所以,在培養(yǎng)基中不提供任何營(yíng)養(yǎng),在配制固體培養(yǎng)基時(shí),瓊脂的用量一般在4~10g/L。加入瓊脂所配制成的固體培養(yǎng)基的優(yōu)缺點(diǎn)為:(1)優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)操作簡(jiǎn)便,對(duì)培養(yǎng)物的支持、通氣較易解決,便于經(jīng)常觀察研究等。(2)培養(yǎng)物的代謝產(chǎn)物培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小,各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢,并且各種養(yǎng)分的擴(kuò)散速度不同,使養(yǎng)分補(bǔ)充慢,而且在培養(yǎng)物周圍的養(yǎng)分比例有變化。培養(yǎng)物的代謝廢物也不容易擴(kuò)散而聚集在周圍,可能抑制植物組織的代謝活動(dòng)。所以,植物組織在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較液體培養(yǎng)慢。4.2組培苗的液體淺層靜置培養(yǎng)從快速繁殖的發(fā)展趨勢(shì)來看,液體培養(yǎng)將取代固體培養(yǎng)。以前液體培養(yǎng)往往要使用恒溫?fù)u床或旋轉(zhuǎn)式振蕩設(shè)備來解決通氣問題,這樣不僅增加成本、占地多,又限制了容量,導(dǎo)致液體培養(yǎng)僅在少量研究中應(yīng)用而很難應(yīng)用于組培苗的大生產(chǎn)。在大花蕙蘭等組織苗的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了液體淺層靜置培養(yǎng)方法的試驗(yàn),結(jié)果表明,這些植物的組織培養(yǎng)皆可采用液體淺層靜置培養(yǎng)。其主要優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)述如下。4.2.1設(shè)備投資不增加采用液體淺層培養(yǎng)不需增加設(shè)備投入,便可解決組織苗在液體培養(yǎng)中的通氣問題。4.2.2降低培養(yǎng)基成本據(jù)計(jì)算,瓊脂約占培養(yǎng)基成本的80%,采用液體淺層靜置培養(yǎng)可大大減少培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。4.2.3生長(zhǎng)迅速,生長(zhǎng)快養(yǎng)分交流補(bǔ)充快,植物組織排出的代謝廢物擴(kuò)散快,自體抑制效應(yīng)較弱,植物組織生長(zhǎng)速度快,生長(zhǎng)量也較大。例如在大花蕙蘭的組織培養(yǎng)中,液體淺層靜置培養(yǎng)的繼代時(shí)間每代可比固體培養(yǎng)的縮短5~6d,叢生芽的增殖數(shù)也可提高。4.2.4織或小苗分散投放采