第十章-園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化

章園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化

Tel科樓B6018E-mail:yingli@150505291592021/5/912021/5/92第一節(jié)園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)第二節(jié)園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化方法第三節(jié)園藝植物轉(zhuǎn)化植株的鑒定第四節(jié)提高外源基因在園藝植物體內(nèi)表達(dá)水平的策略第五節(jié)基因沉默技術(shù)與基因剔除技術(shù)第六節(jié)外源基因在園藝植物中的遺傳第十章園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化2021/5/93植物遺傳轉(zhuǎn)化(plantgenetictransformation)定義:

是應(yīng)用分子重組技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù),有目的地將外源基因或DNA片段插入到受體植物基因組中,并使其在后代植株中得以表達(dá)的過(guò)程。目的:提高產(chǎn)量,品質(zhì)和抗性2021/5/94第一節(jié)園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)植物遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)：指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。2021/5/95一、遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)園藝植物受體系統(tǒng)的要求高效穩(wěn)定的再生能力(2)較高的遺傳穩(wěn)定性(3)穩(wěn)定的外植體來(lái)源

2021/5/96(4)對(duì)抗生素的敏感性

1）選擇性抗生素：在遺傳轉(zhuǎn)化中用于篩選轉(zhuǎn)化體，如卡那霉素、潮霉素2）抑菌性抗生素：在受體材料與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一定時(shí)間后用于抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，防止細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)而產(chǎn)生污染。這類抗生素要求對(duì)植物細(xì)胞無(wú)毒害作用或毒害作用較小，不影響植物細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，如氨芐青霉素、羧芐青霉素、頭孢霉素等

2021/5/97(5)對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性在選擇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)前必須測(cè)試受體系統(tǒng)對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性，只有農(nóng)桿菌侵染敏感的植物才能作為受體系統(tǒng)

農(nóng)桿菌敏感性試驗(yàn)的原理是利用野生型農(nóng)桿菌能在外植體組織中形成腫瘤或發(fā)根，根據(jù)腫瘤的誘導(dǎo)率、發(fā)生時(shí)間及生長(zhǎng)狀態(tài)判斷其敏感程度。其操作程序是把常用的菌株接種在固體瓊脂平板或液體培養(yǎng)基中，用牙簽挑取菌體，穿刺受體植物組織?？稍谕恢仓甑牟煌课弧~片及其中脈、花、莖和幼莖的節(jié)間多次接種，比較其敏感性。然后將植株在光照幾周后觀察腫瘤或發(fā)根的誘發(fā)情況，能形成腫瘤或發(fā)根，則說(shuō)明該植物材料可作為農(nóng)桿菌的一個(gè)宿主，可用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。2021/5/98二、常用的園藝植物受體系統(tǒng)

1、組織受體系統(tǒng)2、原生質(zhì)體受體系統(tǒng)3、生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)2021/5/99（1）組織受體系統(tǒng)

定義：利用園藝植物的葉片、幼莖、子葉、胚軸等外植體培養(yǎng)獲得再生植株的受體系統(tǒng)為組織受體系統(tǒng)。

矮牽牛莖尖花燭葉片離體快速繁殖2021/5/9102021/5/911優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高、外植體來(lái)源容易、轉(zhuǎn)化植株易擴(kuò)繁、適用廣泛等；缺點(diǎn)：外源基因遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體多a）愈傷組織再生系統(tǒng)：指外植體經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織，再分化獲得再生植株2021/5/912b）直接分化再生系統(tǒng)：不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，直接分化出不定芽獲得再生植株優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、體細(xì)胞無(wú)性系變異小等缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率低、嵌合體多2021/5/913（2）原生質(zhì)體受體系統(tǒng)2021/5/914（3）生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)

定義：利用植物自身的生殖過(guò)程，以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱為生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)，也稱為種質(zhì)系統(tǒng)。2021/5/915利用生殖細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，主要有兩種途徑：1）利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞或愈傷組織細(xì)胞，進(jìn)一步分化發(fā)育成單倍體植株，從而建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。2021/5/9162021/5/917利用生殖細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，主要有兩種途徑：2）直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法、花粉粒浸泡法、子房注射法等。2021/5/9182021/5/919與其他受體系統(tǒng)相比生殖受體系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）以具有全能性的生殖細(xì)胞直接為受體細(xì)胞，具有更強(qiáng)的接受外源DNA的潛能2）受體細(xì)胞是單倍體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞無(wú)顯隱性的影響，能是基因充分表達(dá)，有利于性狀的選育。單倍體植株通過(guò)加倍后即可成為純和的二倍體純系，大大縮短了復(fù)雜的選育純化的過(guò)程3）利用植物自身的授粉過(guò)程進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，操作方便、簡(jiǎn)單。局限性：生殖受體系統(tǒng)受季節(jié)限制，只能在短暫的開(kāi)花期進(jìn)行。2021/5/920第二節(jié)園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化方法1）外源裸露基因的直接導(dǎo)入法：物理方法：電穿孔轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法、激光微束空孔轉(zhuǎn)化法、體內(nèi)注射法、超聲波法等；化學(xué)方法：PEG和脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等；2）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法：指通過(guò)將目的基因連接在植物載體上，隨著載體DNA的轉(zhuǎn)移而將外源目的基因整合到植物基因中的方法。該方法主要包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法3）種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)法，包括植物原位真空滲入法和花粉管通道法等。2021/5/921一、外源裸露DNA的轉(zhuǎn)化（一）化學(xué)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法化學(xué)誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化是以原生質(zhì)體為受體，借助于特定的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。目前用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)有聚乙二醇（PEG）、聚鳥(niǎo)氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化學(xué)物質(zhì)是PEG。2021/5/9221、轉(zhuǎn)化原理轉(zhuǎn)化原理：PEG不僅可以使細(xì)胞膜之間或使DNA與膜形成分子橋，促成相互間的接觸和粘連，而且可以改變細(xì)胞膜的表面電荷，干擾細(xì)胞間的作用，從而改變細(xì)胞膜的通透性，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源基因DNA。2021/5/923干擾因素：PEG濃度、分子大小、二價(jià)陽(yáng)離子、溶液pH大小在二價(jià)陽(yáng)離子如磷酸鈣的公共作用下，PEG能使外源DNA沉積在原生質(zhì)體膜表面，并促進(jìn)細(xì)胞對(duì)沉積的DNA進(jìn)行主動(dòng)吸收，從而加快實(shí)現(xiàn)外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞；高pH也可誘導(dǎo)外源DNA分子的吸收，因而PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)常將溶液pH調(diào)到8.0左右。2021/5/9242、轉(zhuǎn)化的基本步驟及其應(yīng)用PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化一般包含以下步驟：a）外源目的基因的制備b）原生質(zhì)體制備c）目的基因和原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)d）轉(zhuǎn)化體的鑒定和再生植物的培養(yǎng)目前PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法在花椰菜、胡蘿卜、向日葵、卡特蘭、柑橘等園藝植物上均有成功的報(bào)道。2021/5/9253、優(yōu)缺點(diǎn)1）優(yōu)點(diǎn)：a）操縱簡(jiǎn)單、成本低，無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備；b）可同時(shí)操作多個(gè)樣品，獲得高存活率和分化率的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；c）DNA直接導(dǎo)入可用于對(duì)基因的瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行快速分析；克服了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化對(duì)受體植物范圍的限制；d）建立了原生質(zhì)體再生體系的植物和組織都可適用，其結(jié)果比較穩(wěn)定，重復(fù)性好。2021/5/9262）缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率低，一般為10-5~10-3。2021/5/927（二）電穿孔轉(zhuǎn)化法

電穿孔轉(zhuǎn)化法，又稱電擊法或“電注射法”。Fromm等首次使用該法成功將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶cat基因?qū)胗衩自|(zhì)體。

2021/5/9281、轉(zhuǎn)化原理1）原理：利用高壓電脈沖作用，在植物細(xì)胞膜或原生質(zhì)體上造成非對(duì)稱穿孔，形成瞬間通道，這種通道孔徑在8.4nm左右，每個(gè)細(xì)胞膜上有上百個(gè)，因此能允許外源基因的進(jìn)入；2）電穿孔法分為兩類：

高壓短時(shí)程法可以得到較高的DNA整合率

低壓長(zhǎng)時(shí)程法可以使其達(dá)到較快的修復(fù)，從而得到較多的瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)物2021/5/9292021/5/9302021/5/9312、操作程序及其應(yīng)用電穿孔法一般操作程序：1）制備含目的基因的質(zhì)粒DNA2）制備植物原生質(zhì)體懸浮液或一定處理的植物組織3）將質(zhì)粒DNA和原生質(zhì)體懸浮液混合后置于200~600V/cm的電場(chǎng)中處理若干秒4）原生質(zhì)體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化子篩選5）再生植物鑒定與培養(yǎng)2021/5/9323、優(yōu)缺點(diǎn)1）電穿孔法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化率較高2）電穿孔法的缺點(diǎn)：必須經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)、易造成原生質(zhì)體損傷，使其再生率降低2021/5/933（三）基因槍轉(zhuǎn)化法基因槍轉(zhuǎn)化法又稱微彈轟擊法，是植物遺傳轉(zhuǎn)化較常用的方法之一，轉(zhuǎn)化率較高，一般為10-3~10-2，但不同物種組織轉(zhuǎn)化率差異很大，最高的可達(dá)2.0%，最差的低于10-4。1、轉(zhuǎn)化原理基因槍法是利用火藥爆炸、高壓氣體和高壓放電作為驅(qū)動(dòng)力，將包裹有生物活性DNA的金屬小顆粒加速，高速轟擊植物組織或細(xì)胞，使外源基因?qū)崿F(xiàn)穿壁并導(dǎo)入受體細(xì)胞中，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出新的植物類型的技術(shù)。2021/5/9342、基本步驟及其應(yīng)用基因槍遺傳轉(zhuǎn)化的基本步驟包括：1）受體細(xì)胞或組織的準(zhǔn)備和預(yù)處理2）DNA微彈的制備3）受體材料的轟擊4）轟擊后外植體的培養(yǎng)和篩選目前，基因槍法分別在桃、番木瓜、蔓越橘、玫瑰、杜鵑、劍蘭、大蒜、生菜、荔枝等園藝植物上成功實(shí)現(xiàn)了目的基因的轉(zhuǎn)化2021/5/9352021/5/9362021/5/937基因槍2021/5/9382021/5/9393、優(yōu)缺點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化法具有下列優(yōu)點(diǎn)：1）無(wú)宿主限制2）操作簡(jiǎn)單，可控程度高，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要調(diào)控微彈的速度和攝入濃度，命中特定層次的細(xì)胞，提高遺傳轉(zhuǎn)化效率；3）靶受體類型廣泛不受基因型的限制，能轉(zhuǎn)化所有具有分生潛力的植物的任何組織或細(xì)胞，包括原生質(zhì)體、根、葉以及種子的胚、子葉、分生組織、愈傷組織、花粉、子房等2021/5/9404）可將外源基因?qū)刖€粒體、葉綠體等植物細(xì)胞的細(xì)胞器，重復(fù)性好，獲得外源基因能穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，這是目前質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究中最常用和最有效的DNA導(dǎo)入方法?；驑屴D(zhuǎn)化法的局限性：1）相對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化相比，基因槍轉(zhuǎn)化法因轟擊的隨機(jī)性導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的效率較低2）成本高2021/5/9413）出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化體和嵌合體的比率大；4）基因插入往往是多拷貝隨機(jī)整合到受體基因組中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，因而遺傳穩(wěn)定性差；5）轟擊過(guò)程中可能造成外源基因的斷裂，使插入的基因成為無(wú)活性的片段等。2021/5/942（四）激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法1.轉(zhuǎn)化原理激光微束穿孔法又叫顯微激光法，指將激光聚焦成微米級(jí)的微束照射細(xì)胞或組織后，利用其熱損傷效應(yīng)時(shí)使細(xì)胞壁上產(chǎn)生可逆性的小孔，使加入到細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。2021/5/9432.基本步驟及其應(yīng)用激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法基本步驟如下：1）含目的基因質(zhì)粒DNA的制備；2）植物外植體材料的選取及高滲預(yù)處理3）預(yù)處理外植體和質(zhì)粒DNA混合并注入小室，然后用激光微束儀照射，照射時(shí)使用波長(zhǎng)為0.35μm，脈寬10~15ns，輸出能量大于2mJ，6000~8000脈沖；4）轉(zhuǎn)化子篩選、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因植株鑒定。2021/5/9443、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法具有操作簡(jiǎn)單、適用性廣、無(wú)宿主范圍限制、能轉(zhuǎn)化細(xì)胞器等特點(diǎn)缺點(diǎn)：所需儀器昂貴，轉(zhuǎn)化效率較低激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法最早用于大田作物，如水稻、小麥、玉米、油菜、棉花等，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于百脈根、馬鈴薯、蘭花等園藝植物的遺傳轉(zhuǎn)化。2021/5/945（五）體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法1.轉(zhuǎn)化原理

體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法利用一定的注射器將外源基因直接注入到已固定的植物細(xì)胞或組織中，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移、獲得轉(zhuǎn)基因再生植株的技術(shù)，包括顯微注射法和直接注射法。2021/5/9462、基本步驟及其應(yīng)用體內(nèi)注射的基本操作步驟：1）制備具有良好表達(dá)活性的目的基因；2）受體細(xì)胞或組織的固定；3）通過(guò)體內(nèi)注射導(dǎo)入已規(guī)定的受體細(xì)胞或組織；4）轉(zhuǎn)化子篩選、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因植株鑒定顯微注射的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是固定受體細(xì)胞。目前，人工固定的方法主要有3種：瓊脂糖包埋法、多聚-L-賴氨酸黏連法、吸管支持法。2021/5/9473、優(yōu)缺點(diǎn)體內(nèi)注射法的優(yōu)點(diǎn)：1）可控制DNA注射量，并可對(duì)多種組織（如小孢子、胚前合子等）進(jìn)行注射；2）轉(zhuǎn)化率較高，整個(gè)操作過(guò)程對(duì)受體細(xì)胞無(wú)毒害作用，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。2021/5/948體內(nèi)注射的局限性：1）每次只能對(duì)一個(gè)細(xì)胞或組織進(jìn)行操作，因而操作繁瑣耗時(shí)，工作效率低；2）注射時(shí)可能刺傷受體細(xì)胞；3）外源DNA整合多為多拷貝，易引起整合部位的突變4）此種方法需以精細(xì)的顯微操作技術(shù)和細(xì)胞低密度培養(yǎng)為基礎(chǔ)，并且必須建立固定植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的技術(shù)，否則很難獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆及轉(zhuǎn)基因植株。2021/5/949（六）脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法1.轉(zhuǎn)化原理脂質(zhì)體法是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能特性，人工用脂類如磷脂等化合物合成的雙層膜囊包裝外源DNA分子或RNA分子，導(dǎo)入原生質(zhì)體或細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)2021/5/9502.基本步驟及其應(yīng)用脂質(zhì)體法有兩種具體方法：1）脂質(zhì)體融合法：先將脂質(zhì)體與原生質(zhì)體共培養(yǎng)，使脂質(zhì)體與原生質(zhì)體膜融合，而后通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用把脂質(zhì)體內(nèi)的外源DNA或RNA分子高效地轉(zhuǎn)入植物的原生質(zhì)體內(nèi)。最后通過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)，再生新的植株；2）脂質(zhì)體注射法：通過(guò)顯微注射把含有遺傳物質(zhì)的脂質(zhì)體注射到植物細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)化。2021/5/9513.優(yōu)缺點(diǎn)脂質(zhì)體法的優(yōu)點(diǎn)：1）保護(hù)DNA在導(dǎo)入細(xì)胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)2）適用的植物種類廣泛，重復(fù)性高，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率較高。脂質(zhì)體法的缺點(diǎn)：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化率低，需要完善的原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生技術(shù)體系支持2021/5/952（一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化1.轉(zhuǎn)化原理根癌農(nóng)桿菌在自然條件下感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生冠癭瘤并合成冠癭堿，為其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖提供碳源、氮源和能源，干擾被侵染植物的生長(zhǎng)。根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞中的Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為9.5×107~1.6×108。二、載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化2021/5/9532021/5/954根癌農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生冠癭瘤2021/5/955根癌農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生冠癭瘤2021/5/9562）Vir區(qū)：該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移3）Con區(qū)：該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間結(jié)合轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為結(jié)合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。4）Ori區(qū)：該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制起始，故稱為復(fù)制起始區(qū)（點(diǎn)）。Ti質(zhì)粒4個(gè)功能區(qū)域：1）T-DNA區(qū)（transferredDNAregion，轉(zhuǎn)移-DNA區(qū)）長(zhǎng)度為15~30kb，是根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中的一段DNA。

2021/5/9572021/5/9582021/5/959根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化大致可以分為以下步驟：1）農(nóng)桿菌識(shí)別并附著到植物細(xì)胞上2）植物信號(hào)分子被農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的由VirA/VirG組成的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)所識(shí)別；3）經(jīng)過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)基因的表達(dá)；4）VirD1和VirD2蛋白共同作用，切割T-DNA的左右邊界，產(chǎn)生一條單鏈T-DNA分子（T鏈）；5）在農(nóng)桿菌細(xì)胞中，1分子VirD2蛋白共價(jià)結(jié)合到T鏈的5′端，形成ssDNA-蛋白復(fù)合體（未成熟T復(fù)合體），然后和幾個(gè)別的Vir蛋白一起，通過(guò)VirB/D4Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS通道）進(jìn)入植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)2021/5/9606）此時(shí)，未成熟T復(fù)合體受到許多VirE2分子的包裹和保護(hù)，形成成熟的T復(fù)合體，并通過(guò)植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核運(yùn)輸；7）在VirD2和E2蛋白的核定位信號(hào)識(shí)別下，成熟T-DNA復(fù)合體通過(guò)細(xì)胞核核孔進(jìn)入植物細(xì)胞細(xì)胞核；8）T復(fù)合體在細(xì)胞核內(nèi)被運(yùn)輸?shù)秸衔稽c(diǎn)；9）T-DNA解包裹；10）T-DNA整合到植物基因組中。2021/5/961根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化步驟2021/5/9622.基本步驟及其應(yīng)用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化方法有：葉盤轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法、整株感染法等以上轉(zhuǎn)化方法的基本程序包括：a）含重組Ti質(zhì)粒的工程菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化；b）選擇合適的外植體；c）工程菌與外植體共培養(yǎng)；d）外植體脫菌及篩選培養(yǎng)；e）轉(zhuǎn)化植株再生及鑒定。2021/5/9632021/5/9643.優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）利用天然載體系統(tǒng)，成功率高，效果好；2）轉(zhuǎn)移的外源基因常為單拷貝整合，很少發(fā)生甲基化和轉(zhuǎn)基因沉默，遺傳穩(wěn)定，而且符合孟德?tīng)栠z傳定律；3）費(fèi)用低，方法簡(jiǎn)單，易于操作；4）與基因槍法結(jié)合使用，效果更佳；5）使用寄主范圍廣，幾乎所有的雙子葉植物都可采用此法。2021/5/965缺點(diǎn)：1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化主要應(yīng)用于雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物，大多數(shù)單子葉植物，尤其是禾本科作物對(duì)農(nóng)桿菌不敏感，限制了它的應(yīng)用范圍；2）農(nóng)桿菌侵染后的外植體再生階段脫菌比較困難，需要長(zhǎng)期使用抗生素，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)麻煩。2021/5/966（二）發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化Ri質(zhì)粒是發(fā)根農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，與Ti質(zhì)粒相似，屬于巨大質(zhì)粒，大小為200~800kb。Ri質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒不僅結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)相似，而且具有相同的寄主范圍和相似的轉(zhuǎn)化原理。

2021/5/967產(chǎn)生毛狀根2021/5/968三、種質(zhì)轉(zhuǎn)化法

定義：以植物自身種質(zhì)細(xì)胞為媒介，將外源DNA導(dǎo)入完整植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)稱為種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該技術(shù)也稱為生物媒體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)或整株活體轉(zhuǎn)化。

2021/5/969種質(zhì)轉(zhuǎn)化法具有的特點(diǎn)：1）目的DNA可以是裸露的DNA，也可以是總DNA或重組質(zhì)粒DNA，還可以是某些DNA片段；2）轉(zhuǎn)化過(guò)程依靠植物自身的種質(zhì)系統(tǒng)或細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)，不需要細(xì)胞分離、組織培養(yǎng)和再生植株等復(fù)雜技術(shù)；3）方法簡(jiǎn)便易行，并與常規(guī)育種緊密結(jié)合2021/5/970（一）植物原位真空滲入法1.轉(zhuǎn)化原理原理：將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理、造傷，使農(nóng)桿菌通過(guò)傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。2021/5/9712.基本步驟及其應(yīng)用植物原位真空滲入法的基本步驟：1）培養(yǎng)生長(zhǎng)到一定階段的植物，一般是開(kāi)始現(xiàn)蕾至開(kāi)花初期；2）制備含目的基因的農(nóng)桿菌菌液；3）將植物倒置浸泡于農(nóng)桿菌菌液中，進(jìn)行真空處理；4）感染植物種植于土壤中，生長(zhǎng)發(fā)育，直到收獲種子；5）種子在選擇培養(yǎng)基上發(fā)芽，進(jìn)行抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)化后代。2021/5/9723.優(yōu)缺點(diǎn)植物原位真空滲入法的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快捷，實(shí)驗(yàn)可靠、成本廉價(jià)，不需要進(jìn)過(guò)組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率高；植物原位真空滲入法的缺點(diǎn)：在遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)需要真空裝置，真空處理前后植株的拔取和重新栽培增加了工作量；應(yīng)用范圍較窄，需要進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)。2021/5/973（二）花粉管通道轉(zhuǎn)化法

定義：花粉管通道轉(zhuǎn)化法是一種借助于植物自身的生殖卵細(xì)胞或受精卵為轉(zhuǎn)化對(duì)象的直接轉(zhuǎn)化技術(shù)。1.轉(zhuǎn)化原理在植物授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開(kāi)花、受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而獲得轉(zhuǎn)化植株。2021/5/9742021/5/9752.基本步驟及其應(yīng)用基本程序包括：1）外源DNA的制備；2）根據(jù)受體植物受精過(guò)程及時(shí)間，確定導(dǎo)入外源DNA的時(shí)間及方法；3）將外源DNA導(dǎo)入受體植物；4）轉(zhuǎn)基因植物目標(biāo)性狀的鑒定及分子檢測(cè)。利用花粉管通道法導(dǎo)入外源基因的方法通常為：花粉粒與外源DNA混合授粉法、花粉粒培養(yǎng)法、柱頭滴柱法、花粉粒轉(zhuǎn)化法和微注射法等。2021/5/9763.優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）不依賴于細(xì)胞、原生質(zhì)體等組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等過(guò)程，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握，成本低，適宜普及；2）適用于多種單、雙子葉植物局限性：1）該種方法只能在開(kāi)花期才能進(jìn)行，而且受體植物的受精過(guò)程及時(shí)間規(guī)律難以掌握；2）重復(fù)性差、成株轉(zhuǎn)化率相對(duì)低2021/5/977（三）種子浸泡轉(zhuǎn)化法定義：浸泡轉(zhuǎn)化法指將供試外植體如種子、胚、胚珠、子房、幼穗甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用可將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并得到整合與表達(dá)的一種轉(zhuǎn)化方法。2021/5/9781.轉(zhuǎn)化原理

浸泡轉(zhuǎn)化是利用細(xì)胞自身的物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)將外源DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞。將外源DNA吸入植物細(xì)胞的途徑有：1）通過(guò)細(xì)胞間隙與胞間連絲組成的網(wǎng)絡(luò)化運(yùn)輸系統(tǒng)可以將外源DNA運(yùn)輸?shù)矫總€(gè)細(xì)胞；2）通過(guò)內(nèi)吞作用將外源DNA攝入細(xì)胞內(nèi)；3）通過(guò)傳遞細(xì)胞的膜透性的改變?yōu)榇蠓肿游镔|(zhì)透過(guò)細(xì)胞提供機(jī)會(huì)2021/5/9792.基本步驟及其應(yīng)用浸泡轉(zhuǎn)化法的基本步驟：1）外源DNA的制備；2）具有生活能力種子的獲得及浸泡處理；3）在浸泡液中加入外源DNA；4）種子培養(yǎng)、發(fā)芽及抗性鑒定。2021/5/9803.優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：種子浸泡轉(zhuǎn)化法是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最簡(jiǎn)單、快捷、便宜的一種轉(zhuǎn)化方法，不需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的組織培養(yǎng)技術(shù)，可以進(jìn)行大批量的受體轉(zhuǎn)化工作，并且容易推廣普及；局限性：轉(zhuǎn)化率低，重復(fù)性差2021/5/981第三節(jié)園藝植物轉(zhuǎn)化植株的鑒定外源基因整合檢測(cè)方法為：Southern雜交、PCR、PCR-Southern雜交、原位雜交、DNA分子標(biāo)記技術(shù)等表達(dá)水平的檢測(cè)方法為：Nourthern雜交、RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸收法（ELISA）、Western較等2021/5/982一、利用選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因鑒定定義：選擇標(biāo)記基因是指在選擇壓下，編碼產(chǎn)物能夠使轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織具有對(duì)抗生素或除草劑的抗性，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則不能在施用選擇劑的條件下生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的基因。選用選擇標(biāo)記基因有利于在大量的細(xì)胞或組織中篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞及植株。2021/5/983植物基因工程中選擇標(biāo)記基因一般具有4個(gè)特征：1）編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的產(chǎn)物，如酶和蛋白質(zhì)；2）基因較小，易構(gòu)成嵌合基因；3）能在轉(zhuǎn)化體中得到充分的表達(dá)；4）容易檢測(cè)并能定量分析。報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物在受體細(xì)胞、組織或器官中具有表達(dá)活性，能夠被快速地測(cè)定的一類特殊用途的基因。2021/5/984（一）抗生素抗性基因鑒定園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化上常用的抗生素抗性基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptⅡ）和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）。1）nptⅡ是卡那霉素抗性基因或氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因，是園藝植物轉(zhuǎn)化中運(yùn)用最廣泛的選擇標(biāo)記基因，其編碼產(chǎn)物對(duì)卡那霉素、慶大霉素的那個(gè)具有抗性?？敲顾啬芨蓴_一般植物細(xì)胞葉綠體及線粒體蛋白質(zhì)的合成，會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。常用濃度為50～100μg/mL。2021/5/9852）hpt基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)潮霉素具有抗性，因而在培養(yǎng)基中篩選的抗生素是潮霉素，常用濃度為30～100μg/mL

2021/5/986（二）除草劑抗性基因鑒定植物遺傳轉(zhuǎn)化中常使用的除草劑抗性基因有bar、aroA、als和PSbA，其中bar和als最為常用。

Bar是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）基因，該酶能使除草劑Basta（有效成分PPT）失活，從而達(dá)到除草劑的目的。2021/5/9872021/5/988（三）顯色或發(fā)光基因鑒定作為理想的植物報(bào)告基因應(yīng)具備以下特征：1）編碼的產(chǎn)物是唯一的，并且對(duì)受體細(xì)胞無(wú)毒；2）表達(dá)產(chǎn)物及產(chǎn)物的類似功能在未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)不存在，即無(wú)背景；3）產(chǎn)物表達(dá)水平穩(wěn)定，便于檢測(cè)等。轉(zhuǎn)基因植物常用的報(bào)告基因有β-葡萄糖醛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（gus）、胭脂堿合成酶基因（nos）、章魚(yú)堿合成酶基因（ocs）、熒光素酶基因（luc）和綠光熒光蛋白基（GFP）基因2021/5/9891.gus基因的鑒定

來(lái)自大腸桿菌的gus基因是應(yīng)用較為廣泛的報(bào)告基因，編碼β-葡萄糖醛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，能作用于底物產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，該反應(yīng)可用于分光光度法測(cè)定，而藍(lán)色沉淀沉積于植物的組織又可直接觀察到，因而gus基因表達(dá)檢測(cè)容易、迅速，只需少量的植物組織即可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定完成。2021/5/9902.nos和ocs基因的檢測(cè)目前采用紙電泳法檢測(cè)nos和ocs基因。電泳后用菲醌染色，菲醌與精氨酸、胭脂堿、章魚(yú)堿作用后在紫外光下顯示黃色熒光，放置兩天后變?yōu)樗{(lán)色。3.熒光素酶基因的鑒定熒光素酶基因主要來(lái)自于細(xì)菌和螢火蟲(chóng)。細(xì)菌熒光素酶以脂肪醛為底物，催化脂肪醛氧化為脂肪酸，同時(shí)放出光子；螢火蟲(chóng)熒光素酶在鎂離子、三磷酸腺苷和氧的作用下，與底物作用生成氧化熒光素，同時(shí)放出光子，便于檢測(cè)。2021/5/9914.綠色熒光蛋白（GFP）基因的鑒定

2021/5/992二、利用重組DNA分子特征鑒定（一）重組DNA分子酶切圖譜鑒定目的基因插入會(huì)使表達(dá)載體DNA限制性酶切圖譜發(fā)生變化，提取轉(zhuǎn)化細(xì)菌的質(zhì)粒，DNA酶切后做電泳觀察其酶切圖譜，即可分析外源基因是否正確插入載體中。

2021/5/993（二）PCR技術(shù)鑒定2021/5/994（三）Southern雜交技術(shù)鑒定2021/5/995三、利用外源基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鑒定（一）Northern雜交與點(diǎn)雜交技術(shù)鑒定2021/5/996（二）Western雜交技術(shù)鑒定2021/5/997（三）蛋白質(zhì)免疫測(cè)定技術(shù)鑒定1.酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法（ELISA）指特殊的抗體被結(jié)合固定在固體表面如微孔上，加入樣品，未被結(jié)合的成分被洗掉，然后通過(guò)加上酶的抗體來(lái)檢測(cè)抗原，未被結(jié)合的成分再次被洗掉，酶與底物反應(yīng)的顏色與樣品中抗原的含量成正比。在轉(zhuǎn)基因植株中，含有抗體的均可采用此方法進(jìn)行。2.免疫熒光技術(shù)免疫熒光，是以抗體為基礎(chǔ)，一抗與結(jié)合有熒光色素的二抗結(jié)合，所發(fā)出的熒光可由免疫熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。2021/5/998第四節(jié)提高外源基因在園藝植物體內(nèi)

表達(dá)水平的策略一、轉(zhuǎn)基因園藝植物中外源基因的沉默（一）轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象定義：園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化的目的是獲得能高效表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系，但大量的實(shí)驗(yàn)表明，導(dǎo)入并整合進(jìn)受體基因組中的外源基因在轉(zhuǎn)化體的當(dāng)代或其后代中出現(xiàn)表達(dá)受到抑制，甚至完全不表達(dá)的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)基因沉默。轉(zhuǎn)基因沉默分為：轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默（TGS）轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默（PTGS）.2021/5/999第四節(jié)提高外源基因在園藝植物體內(nèi)表達(dá)水平的策略(二)引發(fā)轉(zhuǎn)基因沉默的因素1.DNA甲基化2021/5/9100第四節(jié)提高外源基因在園藝植物體內(nèi)表達(dá)水平的策略2.重復(fù)序列定義：重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默（RIGS）指多拷貝的外源基因以正向或反向串聯(lián)的形式整合在植物基因組上而導(dǎo)致的外源基因不同程度的失活。重復(fù)序列有兩種作用方式：1）順式失活，指相互串聯(lián)或緊密連鎖的重復(fù)基因失活；2）反式失活，指由于基因啟動(dòng)子間同源序列相互作用引發(fā)的基因失活現(xiàn)象，也指某一基因的失活狀態(tài)引起同源的等位或非等位基因的失活。2021/5/9101第四節(jié)提高外源基因在園藝植物體內(nèi)表達(dá)水平的策略3.位置效應(yīng)定義：位置效應(yīng)是指外源基因在植物基因組中的插入位置對(duì)其表達(dá)的影響。4.共抑制現(xiàn)象定義：共抑制現(xiàn)象指外源基因的導(dǎo)入不但使外源基因不能高效表達(dá)，還會(huì)抑制與其同源的內(nèi)源基因的表達(dá)。共抑制最早是在轉(zhuǎn)苯基苯乙烯酮合成酶（CSH）的矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的。目前，在真菌、動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象分別稱為抑制、RNA干擾（RNAi）。共抑制現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）。2021/5/9102第四節(jié)提高外源基因在園藝植物體內(nèi)表達(dá)水平的策略5.反義RNA

2021/5/9103二、提高外源基因在園藝植物體內(nèi)表達(dá)水平的策略（一）采用合適的轉(zhuǎn)化方法園藝植物外源基因的轉(zhuǎn)化方法很多，不同轉(zhuǎn)化方法對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響不同。常用的有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法等?；驑尫▽?dǎo)入的外源基因?yàn)槎嗫截悾r(nóng)桿菌介導(dǎo)法能夠減少導(dǎo)入外源基因的拷貝數(shù)，減少多拷貝植株的數(shù)量，并且已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)外源基因的單拷貝，從而避免重復(fù)序列產(chǎn)生的基因沉默現(xiàn)象。2021/5/9104（二）使用信號(hào)肽外源基因在植物組織細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其表達(dá)產(chǎn)物受細(xì)胞中大量蛋白酶的作用而降解，造成外源蛋白積累量的減少。因此，采取措施保護(hù)外源蛋白不受降解是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成功的重要一環(huán)。（三）使用強(qiáng)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)子是決定外源基因轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)鍵因素，在構(gòu)建外源基因載體時(shí)，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，是基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加。2021/5/9105誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可分為3種類型：1）A型啟動(dòng)子可以被生長(zhǎng)素、脫落酸等植物生長(zhǎng)物質(zhì)及創(chuàng)傷誘發(fā)所產(chǎn)生的系統(tǒng)素所誘導(dǎo)；2）B型有高溫、低溫、高鹽、重金屬等環(huán)境因子誘導(dǎo)；3）C型是指能夠?qū)θ斯ず铣傻幕瘜W(xué)誘導(dǎo)物，如四環(huán)素、苯并噻二唑等發(fā)生反應(yīng)的啟動(dòng)子。目前，利用這些啟動(dòng)子獲得的轉(zhuǎn)基因植株能應(yīng)用于生產(chǎn)的還較少，但也有少量成功的報(bào)道。而組織或器官特異性表達(dá)的啟動(dòng)子則應(yīng)用的相對(duì)較多。2021/5/9106（四）使用終止子終止子雖然不具有增強(qiáng)子的功能，但不同來(lái)源的植物基因終止子對(duì)外源基因的表達(dá)有著很大的影響。（五）使用增強(qiáng)子利用具有組織與發(fā)育特異性調(diào)控作用的增強(qiáng)子構(gòu)建嵌合基因，是提高外源基因表達(dá)效果的有效措施之一。（六）使用植物偏愛(ài)的密碼子植物基因具有自己特有的AT/GC堿基偏愛(ài)性，即密碼子偏愛(ài)性。在體外，應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)外源基因做修飾改造，使其改造成植物偏愛(ài)的密碼子是十分必要的。2021/5/9107（七）使用基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MAR）又稱核骨架結(jié)合序列（SAR），是存在于真核細(xì)胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)特異性結(jié)合的DNA序列，大小為300～2000bp，富含AT和保守結(jié)構(gòu)區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，MAR是一種新的順式作用元件，將其置于所轉(zhuǎn)基因的兩側(cè)，構(gòu)建成MAR-gene-MAR，可以創(chuàng)造一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。這樣可克服基因組對(duì)外來(lái)基因的識(shí)別和抑制，并阻隔了周圍染色質(zhì)順式調(diào)控元件的影響，減少位置效應(yīng)，顯著提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。2021/5/9108（九）改造外源基因基因結(jié)構(gòu)組成5′端序列、poly（A）信號(hào)和內(nèi)含子等對(duì)轉(zhuǎn)化外源基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，真核生物mRNA起始密碼子前約100bp的非轉(zhuǎn)譯序列是其正常轉(zhuǎn)譯所必須的，且這段RNA的堿基組成對(duì)轉(zhuǎn)譯活性有重要影響。（八）防止甲基化

2021/5/9109第五節(jié)基因沉默技術(shù)與基因剔除技術(shù)一、基因沉默技術(shù)（一）病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)定義：病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）是一種通過(guò)抑制基因轉(zhuǎn)錄水平研究植物基因功能的方法。VIGS技術(shù)技術(shù)應(yīng)用最成功的植物是本生煙草。煙草脆裂病病毒（TRV）已經(jīng)被用于在煙草中進(jìn)行大規(guī)模高通量的基因功能研究。2021/5/9110VIGS技術(shù)的具體內(nèi)容：1.原理：VIGS是利用植物體內(nèi)天然存在的免疫機(jī)制，將目的基因片段構(gòu)建到病毒載體中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作為病毒的一部分同病毒一起復(fù)制并擴(kuò)散到植株植物，植物體的防御機(jī)制被病毒激活后，在識(shí)別病毒和目的基因的同時(shí)，將內(nèi)源的目的基因mRNA降解，從而達(dá)到基因沉默的目的，屬于一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。2021/5/91112.基本操作步驟VIGS技術(shù)的基本操作步驟：1）克隆靶基因；2）構(gòu)建含靶基因核心序列的病毒遺傳載體；3）將病毒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，以真空滲透或注射滲透的方式感染幼嫩植株；4）篩選目的表型突變體。2021/5/91123.優(yōu)缺點(diǎn)VIGS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：1）僅用一個(gè)蜘蛛就能鑒定一個(gè)表型；2）結(jié)果可被迅速