基于mvilles-雙2-羥基苯亞甲基鄰苯二胺合銅修飾碳基網絡電路菌免疫傳感電極的制備與檢測

基于mvilles-雙2-羥基苯亞甲基鄰苯二胺合銅修飾碳基網絡電路菌免疫傳感電極的制備與檢測

1修飾電極的制備感染嫌疑人的卵（p24）是眾所周知的。其檢測方法包括酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫熒光分析(IFA)等。其中ELISA法最常用,但靈敏度不高,“窗口期”長,假陽性率高。后兩種方法靈敏可靠,但所需儀器昂貴,操作復雜,不適宜于基層醫(yī)療部門作p24現(xiàn)場篩查。安培免疫傳感器具有極高的靈敏度和特異性,適合于構建痕量p24的快速檢測技術,有望縮短艾滋病“窗口期”并降低檢測成本。但目前該類傳感器在臨床上應用還存在一些不足:一是通常采用酶標抗體結合在電極表面,通過酶催化反應(如HRP酶對H2O2催化)引起測試體系電信號變化進行測定。由于酶昂貴且固定于電極表面易失活,導致電極使用壽命降低;二是當電極上的抗原/抗體發(fā)生結合后生成物很難除去,其表面無法更新,測定數(shù)次后需要重新修飾,費時繁瑣;三是常見的電極材料(如金、玻碳等)價格昂貴,制備成本高。N,N′-雙(2羥基苯亞甲基)鄰苯二胺合銅(CuRb)具有催化H2O2的特性,可替代HRP酶。碳納米管和納米金常被用于固定抗原/抗體分子而制備生物探針,進而將其修飾到電極表面,可獲得高靈敏度、檢出時間顯著縮短的安培免疫傳感器。閔麗根等采用納米金、多壁碳納米管等合成了納米復合物,用其固定癌胚抗原(CEA)抗體制得了靈敏度和穩(wěn)定性俱佳的CEA傳感器,但該類傳感器仍無法實現(xiàn)更新。Fe3O4/Au組裝型金磁納米微粒(簡稱GMP)兼具Fe3O4的超順磁性和膠體金的生物相容性,可用于抗體固定并易于實現(xiàn)磁性分離,近年來在生化分析中應用日漸廣泛。如合成MWNTs/GMP復合粒子(MWNTs-GMP)并包被p24抗體(antip24),由此制備的“磁性碳納米管探針”可方便地在外磁場作用下在電極表面吸附解吸,獲得的免疫傳感器可再生,由此可大大簡化檢測探針在電極上修飾過程。絲網印刷碳電極(SPCEs)可批量生產,具有成本低、電極面積可控等突出優(yōu)點,非常適合于構建廉價的一次性安培免疫傳感器。本研究采用CuRb修飾,在SPCEs電極上構建了H2O2傳感器(SPCE︱CuRb),并合成了MWNTs-GMP,用以包被p24抗體;通過外加磁場將MWNTs-GMP/antip24探針吸引到SPCE︱CuRb表面,制備了電極表面可更新的磁控HIVp24無酶型一次性安培免疫傳感器,并用于HIV患者血清檢測。2實驗部分2.1raingx射線熒光檢測CHI-660B電化學分析工作站(上海辰華公司);三電極集成的SPCEs(西班牙DropSens公司,工作電極為修飾電極,參比電極為Ag/AgCl電極,對電極為碳電極);HitachiS-3400N型能譜掃描電鏡(日本Hitachi公司);S2RANGERX射線熒光光譜儀(德國Bruker公司);NdFeB稀土強磁鐵(杭州強磁鐵器材有限公司,磁場感應強度為0.1～1.0mT)。1mg/L的鼠抗人HIVp24抗原及其單克隆抗體(antip24)試劑盒(美國Epitomics公司);牛血清蛋白(BSA,美國Sigma公司);CuRb參照文獻制備;Fe3O4/Au微粒(5mg/L,粒徑(50±1.2)nm);吸附抗體量:25mg人IgG/mL(陜西北美基因股份有限公司,濃度為5×107個/mL);羧基化多壁碳納米管MWNTs(深圳納米港公司,純度大于90%);Nafion溶液(上海河森電氣公司);HIVp24抗體陽性滅活血樣4份,陰性血樣6份(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗科)。實驗用水為超純水(美國Millipore公司),其它試劑均為分析純。2.2spce—SPCE|CuRb/MWNTs-GMP/antip24免疫電極的制備和表征MWNTs-GMP/antip24:將羧基化MWNTs浸入到0.36mol/L乙二胺溶液(pH=7.0的PBS,含50mmol/L碳二亞胺作偶合劑)中胺基化。將胺化的MWNTs浸入5g/LGMP溶液(pH6.5,室溫)中反應2.5h,即得5mg/LMWNTs-GMP溶液。按照GMP說明書的抗原包被步驟和包被量,在5mLpH7.0,0.02mol/LTris-HCl中加入5μL5mg/LMWNTs-GMP與100μL1μg/Lantip24,25℃下振蕩反應20min,磁性分離棄上清液。再加入5mLPBS和5μL牛血清蛋白BSA(1000U/mL)。25℃下攪拌1h,以封閉未包被antip24的GMP表面,磁性分離棄上清液。重復操作3次,即得最終產物,制備過程如圖1。免疫電極:在SPCE電極(3.0cm×2.0cm×2mm)反應腔中滴加10μL0.1mol/LCuRb+10μL4%(w/V)的Nafion成膜,得到SPCE|CuRb電極。待電極表面干燥后,在反應腔中加入20mL200mg/LMWNTs-GMP/antip24,并置于外加磁場1min(B=0.3mT,H方向和電極表面垂直)自然晾干5min即得,其制備過程如圖2。2.3免疫傳感器的溫育參照文獻的方法,分別測定在5mL除氧的pH7.0的0.1mol/LPBS溶液和含1mmol/LH2O2的相同底液中,免疫傳感器在-300mV電解120s時的安培響應I0和IH。將免疫傳感器在含待測p24的溶液中于室溫下溫育15min,在同樣條件下測定含1mmol/LH2O2的pH7.0PBS溶液中的安培響應I。CR(%)=(IH-I)/(IH-I0)+100%,表達了傳感器溫育后安培響應的降低百分率,其與溶液中待測p24濃度在一定范圍內成正比。分析完成后,取出電極下部的磁鐵,用0.1mol/LPBS(pH7.0)沖洗10次,脫去表面的探針,使電極再生。2.4血清spce表達按照文獻的方法,取3～5mL靜脈血,室溫放置1～2h,待血液凝固、血塊收縮后,置入10mL離心管,磁力攪拌15min,吸出上層2μL血清至含25μLPBS的SPCE反應腔中,采用2.4節(jié)的方法進行定量分析。ELISA測定參照試劑盒說明書進行。3結果與討論3.1傳感器表面元素組成采用掃描電鏡(SEM)分別對不同電極表面進行了表征。實驗發(fā)現(xiàn),SPCE|CuRb/MWNTs-GMP表面有很多長條狀的碳納米管,直徑為10～20nm;組裝的GMP分布在MWNTs四周,粒徑約為50nm(圖3a)。在磁場下SPCE|CuRb/MWNTs-GMP/antip24修飾電極表面(見圖3b)。GMP在電極表面分布較均勻,直徑增大到200～300nm。常溫下MWNTs-GMP/antip24的飽和磁化強度為5.2A·m2/kg,剩磁和矯頑力均為0,其在外加磁場前后的沉降見圖3c,說明其具有良好的超順磁性。采用紅外光譜表征了傳感器表面(圖3d-2)和羧基化碳納米管(圖3d-1)相比,電極在3385,3384和1632cm-1左右出現(xiàn)了明顯的NH振動吸收峰,這是由含酰胺鍵的MWNTs-GMP引起的。采用X射線熒光光譜對傳感器表面進行表征,出現(xiàn)了Fe-Kβ和Lα峰(31.09°、35.21°),Cu-Kα(42.51°),S-Kα峰(112.34°)。由于antip24抗體富含甲硫氨基酸,說明CuRb,Fe3O4和antip24均被修飾到免疫電極表面。電化學交流阻抗是研究電極表面與溶液間電子傳遞關系的有效方法。圖4為不同電極在K3Fe(CN)6溶液中的交流阻抗圖譜,高頻區(qū)的半圓直徑表示電子傳遞阻抗(Ret)。圖4a顯示,SPCE|CuRb阻抗約為21.7kΩ。而SPCE|CuRb/MWNTs-GMP阻抗(圖4b)約為11.4kΩ。這可能因為MWNTs-GMP微粒增加了電極導電比表面積,提高了FeCN電子傳遞速率,因此降低了其電子傳遞阻抗。免疫傳感器的Ret上升為22.8kΩ(圖4c),這是由于antip24本身是一層絕緣性蛋白質,阻礙了Fe(CN)3-6與電極界面間電子傳遞。將此傳感器在100μg/Lp24溶液中溫育15min后,Ret進一步增加到29.8kΩ(圖4d),這說明p24和antip24形成的免疫復合物,進一步阻礙了K3Fe(CN)6在電極表面的電子傳遞。3.2還原生成催化SPCE|CuRb修飾電極在掃速100mV/s下pH7.0PBS中的循環(huán)伏安(CV)圖顯示出一對穩(wěn)定的氧化還原峰(圖5a)。當在底液中加入1mmol/LH2O2后,還原峰增大而氧化峰減小,說明SPCE|CuRb對H2O2還原產生催化(圖5b)。SPCE|CuRb/MWNTs-GMP的氧化還原電流較SPCE|CuRb大幅度提高(圖5c);而此電極對H2O2還原也可產生催化,且催化電流增長絕對值顯著高于SPCE|CuRb(圖5d)。這是因為:MWNTs和GMP均具有好的導電性,當兩者形成復合微粒后,導電性更佳。該電極氧化還原峰電流均隨掃速(50～300mV/s)增加而線性增大,表現(xiàn)出明顯的表面控制過程。通過測定不同掃速時的峰電位差,利用Laviron方程可計算出該過程平均電子傳遞速率常數(shù)為(2.71±0.31)/s;CuRb表面覆蓋度為(1.03±0.22)×10-10mol/cm2,此數(shù)值相當于電極表面覆蓋的為單分子層。反應電子數(shù)n=1.72≈2,表明電極表面發(fā)生CuⅡ/Cu(0)的電子轉移。3.3還原峰的檢測免疫傳感器在PBS底液中的CV圖(圖6b)與未包被antip24探針的SPCE|CuRb/MWNTs-GMP(圖6a)相比,氧化峰和還原峰電位間距(ΔEp=84mV)基本不變,但是峰電流均減少。推測是antip24為絕緣性蛋白質,可阻礙CuRb與電極間的電子傳遞。當在底液中加入1mmol/LH2O2后,此傳感器還原峰增大而氧化峰減小(圖6c),說明其對H2O2具有良好的還原催化。將電極在0.2%BSA中溫育后,對H2O2的催化電流I0無明顯減少(圖6d),表明其非特異性吸附很小。將此電極在100μg/Lp24溶液中溫育15min后,電流明顯減小(圖6e),電流減少值△I0和p24的加入量成正比,可用于定量分析。將此傳感器放入pH4.0～8.0的PBS緩沖液中進行循環(huán)掃描,電極的氧化還原峰電勢隨pH的增加不移動,推測是由于CuRb中無得失H+的基團。檢測機理推斷如圖7:Cu(Ⅱ)L在電極上被還原為Cu(0)L,溶液中的H2O2通過擴散達到電極溶液界面,將Cu(0)L氧化成Cu(Ⅱ)L,而自身被還原成H2O。當p24和antip24發(fā)生免疫結合后,免疫生成物使得H2O2達到電極表面的傳質受阻,催化電流下降。3.4spce電極內部分抗氧化藥物pyp3SPCE|CuRb電流響應隨著Nafion膜中CuRb濃度增加而增大。當CuRb濃度大于1mmol/L時,峰電流基本不變。因此選擇1mmol/LCuRb固定在電極表面。測定了H2O2在傳感器上的安培響應,發(fā)現(xiàn)其響應迅速,電流達到穩(wěn)態(tài)所需時間僅為2s,顯著高于納米金修飾電極;響應電流與H2O2濃度在0.5～5.0mmol/L范圍內呈線性關系,濃度再提高電流改變不大,所以H2O2濃度采用5.0mmol/L。免疫反應受到溶液pH值、溫育時間、SPCE表面磁場強度、MCNTs-GMP/antip24探針濃度等影響。研究表明,峰電流在pH3.5～7.0逐漸增大,pH大于7.0后開始減小,因此最佳pH值選擇為7.0。在室溫下,催化電流的下降值隨時間延長而增加,當達到15min后趨于穩(wěn)定值,說明此時電極表面免疫反應已進行完全,這較一般的ELISA溫育時間50～60min明顯縮短。這是由于本方法基于一次性免疫分析,較ELISA法減少了二抗加入步驟;同時,SPCE電極內反應腔僅40μL,空間狹小,p24抗原/抗體碰撞幾率增加,故而溫育時間較短?？疾炝烁患娢粚2O2安培測定的影響,隨著電位的負移動,電流大幅度增大。當電位達到-300mV時,電流達到一個平臺,因此選擇-300mV作為檢測電位。隨著外加磁場增大,傳感器對抗原檢測后的電流減少值ΔI0不斷增加。這是因為磁性越強,MWNTs-GMP/antip24探針在電極表面富集量越多,與p24發(fā)生免疫結合量增多,ΔI0也越大;當磁場達到0.3mT后,電流響應趨于穩(wěn)定,表明此時探針在電極表面已達到飽和。在反應腔中分別加入20μL的50,100,200,300和400mg/LMCNTs-GMP/antip24探針,考察了傳感器對100μg/Lp24的檢測信號。研究發(fā)現(xiàn),探針濃度越大,ΔI0越大;探針濃度大于200μg/L后,ΔI0不再變化。這是因為探針在電極表面已經飽和。綜上所述,傳感器的最佳制備和分析條件為:在電極反應腔中加入20μL200μg/LantiMCNTs-GMP/antip24探針,用0.3T磁場強度的永磁鐵吸附1min,晾干,加入適量p24樣品,室溫下溫育15min,再加入5mmol/LH2O2,電解電位-300mV。3.5測定結果重現(xiàn)性當電極表面的磁場撤去后,傳感器的電流響應幾乎沒有變化,對100μg/Lp24測定結果重現(xiàn)性很好(RSD<3%)。推測原因是:antip24蛋白上的酪氨酸和SPCE石墨工作電極可實現(xiàn)π-π吸附,故而antip24-GMP通過重力和物理吸附作用修飾在SPCE表面而不易流失。3.6檢測線性范圍由于示差脈沖伏安法(DPV)比循環(huán)伏安法(CV)具有更高的靈敏度,所以采用了DPV方法對樣品進行了檢測。在優(yōu)化的測定條件下,獲得的p24測定DPV曲線和校正曲線顯示,檢測線性范圍為0.6～160μg/L,r=0.9986。采用3倍標準偏差法(3σ)獲得的檢出限分別為0.32μg/L。3.7精密度和穩(wěn)定性取不同時間、不同批間制備的免疫傳感器,對30和40μg/Lp24重復測定4次,獲得的組內相對標準偏差為2.8%和3.4%,說明其具有良好精密度。將傳感器在4oC儲存于pH6.5的PBS中放置45d后,信號變化<5%,說明其具有較好的穩(wěn)定性。利用同一根電極在外加磁場作用下,重復吸附MWNTs-GMP/antip24探針3次,對100和25μg/Lp24樣品測定結果分別為99.3和24.2μg/L;RSD(n=3)分別為2.2%和2.4%,這說明該傳感電極具有較好制備重復性,可以再生使用。3.8半胱氨酸縮合物pa人血清中主要干擾物對傳感器檢測p24的影響實驗表明:當p24濃度為10μ